In Vitro Różnicowanie ludzkich monocytów pochodzących z PBMC do makrofagów M1 lub M2 w podłożu komórkowym bez surowicy i bez ksenonów

Makrofagi to rezydujące w tkankach profesjonalne fagocyty i komórki prezentujące antygen (APC), które różnicują się z krążących monocytów krwi obwodowej. Pełnią one ważne funkcje aktywne i regulacyjne w odporności wrodzonej i adaptacyjnej.¹ Aktywowane makrofagi o różnych fenotypach są rutynowo klasyfikowane jako makrofagi M1 (CAM) lub makrofagi M2 (AAM). Klasycznie aktywowane makrofagi M1 obejmują immunologiczne komórki efektorowe o fenotypie ostrego stanu zapalnego. Są one bardzo agresywne wobec bakterii i wytwarzają duże ilości limfokin.² Alternatywnie aktywowane, przeciwzapalne makrofagi M2 można podzielić na co najmniej trzy podgrupy. Podtypy te mają różne funkcje, w tym regulację odporności, utrzymanie tolerancji i naprawę tkanek / gojenie się ran.^1,2 Rzeczywiście, komórki linii makrofagów wykazują niezwykłą plastyczność w odpowiedzi na bodźce endogenne, jak i egzogenne, co może pozwolić na konwersję początkowych procesów polaryzacji M1/M2², na przykład makrofagi spolaryzowane M2 mogą w pewnych warunkach przekształcić się w stan aktywowany M1.

Pierwotne ludzkie makrofagi są trudne do wyizolowania w wystarczających ilościach z tkanek i nie namnażają się w hodowli. Ponadto powszechnie przyjmuje się, że uzyskane komórki często wykazują znaczną heterogenność fenotypową. Makrofagi pochodzące z monocytów stanowią doskonałą alternatywę, ponieważ monocyty krwi ludzkiej są łatwo dostępne w dużych ilościach i mogą być różnicowane w makrofagi in vitro. PromoCell Macrophage Generation Media zostały zaprojektowane do skutecznego różnicowania wysoce czystych makrofagów M1 lub M2 bezpośrednio z PBMC jako materiału wyjściowego. Pożywki do generowania makrofagów DXF są zdefiniowane jako wolne od surowicy/ksenozy i zapewniają kontrolowane środowisko hodowlane pozbawione wszelkich bodźców pochodzących od składników zwierzęcych - jest to znacząca korzyść w odniesieniu do monocytów i makrofagów stanowiących wysoce reaktywne komórki odpornościowe. W rezultacie pożywki te pozbawione są niepożądanych i szkodliwych efektów przypisywanych FBS, a tym samym umożliwiają standaryzowane i kontrolowane różnicowanie makrofagów.Różnicowanie monocytów in vitro w obecności pożywki PromoCell M1-Macrophage Generation Medium DXF (C-28055) prowadzi do różnicowania makrofagów., zawiera GM-CSF) prowadzi do makrofagów wykazujących M1-podobną polaryzację CD68+/ CD80+/CD163- makrofagów, podczas gdy M2-Macrophage Generation Medium DXF (C-28056, zawiera M-CSF) promuje M2-podobną polaryzację CD68+/CD80-/CD163+ makrofagów. Macrophage Base Medium DXF (C-28057) reprezentuje konfigurowalną przez użytkownika wersję bez cytokin i dlatego wymaga odpowiedniego uzupełnienia przez użytkownika. W razie potrzeby użytkownik może przeprowadzić niestandardową aktywację i polaryzację podtypu makrofagów spolaryzowanych M1/M2.

Rysunek 1. Przegląd protokołu z użyciem PromoCell M1/M2 Macrophage Generation Medium DXF.

Protokół różnicowania makrofagów

1. Izolacja komórek jednojądrzastych (dzień 0). Wyizoluj świeże PBMC z kożuszków przy użyciu rutynowego protokołu.6 PBMCs/ml w Monocyte Attachment Medium (C-28051).
2. Pozwolić na przyłączenie monocytów (dzień 0).Umieść świeżo wyizolowane PBMC w odpowiedniej ilości pożywki Monocyte Attachment Medium (C-28051), np. 15 ml pożywki na kolbę T-75. Użyj gęstości wysiewu 1 mln/cm² dla komórek jednojądrzastych z zawartością monocytów ≥25% i 1,5 mln/cm² dla zawartości monocytów <25%. Inkubować przez 1-1,5 godziny w temperaturze 5% CO₂ i 37°C w inkubatorze bez dalszych manipulacji.
3. Przygotować kompletną pożywkę do generowania makrofagów DXF (dzień 0).Przygotuj pożywkę do generowania makrofagów DXF (C-28055, C-28056) dodając rozmrożoną mieszankę suplementów aseptycznie do pożywki podstawowej. Delikatnie wymieszać do uzyskania jednorodnej mieszaniny. Następnie dodać Cytokine Mix M1 lub M2, odpowiednio.
4. Przepłukać frakcję komórek przylegających (dzień 0).  Poprzez energiczne wirowanie naczynia do hodowli tkankowej rozluźnić nieprzylegające komórki i odessać je. Przepłukać przylegające komórki, tj. monocyty, trzykrotnie ciepłą pożywką Monocyte Attachment Medium (C-28051) poprzez wirowanie naczynia i odessanie supernatantu.
5. Rozpocząć różnicowanie makrofagów (dzień 0).Dodaj odpowiednią ilość kompletnej pożywki do generowania makrofagów M1 lub M2 DXF (C-28055, C-28056) do komórek, np.20 ml na kolbę T-75 i inkubować przez 6 dni w temperaturze 37°C i 5% CO₂ bez zmiany pożywki.
6. Kontynuować proces różnicowania (dzień 6).Dodaj kolejne 50% do 75% objętości świeżej kompletnej pożywki do generowania makrofagów M1 lub M2 DXF (C-28055, C-28056) do komórek. Inkubować niedojrzałe makrofagi przez kolejne 3 dni w temperaturze 37°C i 5% CO₂.
7. Krok opcjonalny: aktywacja makrofagów (dzień 7). W celu specyficznej aktywacji makrofagów cała objętość hodowli jest uzupełniana odpowiednimi bodźcami wybranymi przez klienta. Nie należy zmieniać pożywki, wystarczy dodać czynniki aktywujące. Przykłady aktywacji makrofagów przez określone bodźce: Klasycznie aktywowane makrofagi M1 mogą być generowane przez dodanie do makrofagów M1 IFN-γ (50 ng/ml) i LPS (10 ng/ml). Aktywacja M2a makrofagów M2 jest osiągana przez 20 ng/ml IL-4. Suplementacja kompleksami immunologicznymi i IL-1β lub LPS wywoła aktywację M2b, podczas gdy IL-10, TGFβ lub glukokortykoidy prowadzą do aktywacji M2c makrofagów M2. Alternatywny typ aktywowanych makrofagów M1 można uzyskać poprzez aktywację makrofagów M2 za pomocą IFN-γ i LPS [2].
8. Wymiana pożywki (dzień 9). Odessać pożywkę zawierającą komórki zawiesiny i zebrać ją w probówce do wirowania. Natychmiast dodaj pipetą do komórek świeżą kompletną pożywkę PromoCell Macrophage Generation Medium DXF (C-28055, C-28056) uzupełnioną odpowiednimi cytokinami/czynnikami aktywującymi. Wirować komórki w probówce przez 15 minut przy 350 x g w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i ostrożnie ponownie zawiesić komórki w niewielkiej ilości świeżej pożywki. Połączyć ponownie zawieszone komórki w probówce z przylegającymi komórkami w świeżej pożywce znajdującej się w naczyniu do hodowli tkankowej. Inkubować do następnego dnia w temperaturze 37°C i 5% CO₂.
9. Makrofagi są gotowe (dzień 10). Makrofagi mogą być teraz używane bezpośrednio na płytkach, na których rezydują, np. podczas wykonywania testów fagocytozy. Utrzymanie hodowli przez okres do trzech tygodni jest możliwe dzięki cotygodniowej wymianie pożywki na świeżą, kompletną pożywkę Macrophage Generation Medium DXF (C-28055, C-28056).

Wyniki

Rysunek 2. Morfologia i aktywność fagocytarna ludzkich makrofagów M1 pochodzących z PBMC. A) Jasne obrazy fazowe makrofagów M1 24 godziny po umieszczeniu w PromoCell Macrophage Generation Medium DXF. B) Kriokonserwowane makrofagi M1 PromoCell połykają dużą liczbę fluorescencyjnie znakowanych bakterii E.coli..

Rysunek 3. Morfologia i aktywność fagocytarna ludzkich makrofagów M2 pochodzących z PBMC. A) Jasne obrazy fazowe makrofagów M2 24 godziny po umieszczeniu w PromoCell Macrophage Generation Medium DXF. B) Kriokonserwowane makrofagi M2 PromoCell połykają dużą liczbę fluorescencyjnie znakowanych bakterii E.coli..

Rysunek 4. Analiza cytometrii przepływowej makrofagów M1 i M2 wygenerowanych w dniu 10 w PromoCell Macrophage Generation Medium DXF. Świeże komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) umieszczono w podłożu Monocyte Attachment Medium. Oczyszczone monocyty różnicowano przez 10 dni bez wykonywania opcjonalnego etapu aktywacji. Makrofagi M1 wykazują profil markerów CD68+ (99% dodatnich) i CD80+ (83% dodatnich), podczas gdy makrofagi M2 wykazują profil markerów CD68+ (99% dodatnich) i CD163+ (95% dodatnich).

Referencje

1. Murray PJ, Wynn TA. 2011. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nat Rev Immunol. 11(11):723-737. https://doi.org/10.1038/nri3073

2. Murray PJ, Wynn TA. 2011. Obstacles and opportunities for understanding macrophage polarization. Journal of Leukocyte Biology. 89(4):557-563. https://doi.org/10.1189/jlb.0710409

3. Gordon S. 2003. Alternative activation of macrophages. Nat Rev Immunol. 3(1):23-35.

4. Khramtsova G, Liao C, Khramtsov A, Li S, Gong C, Huo D, Nanda R. 2009. The M2/Alternatively Activated Macrophage Phenotype Correlates with Aggressive Histopathologic Features and Poor Clinical Outcome in Early Stage Breast Cancer.. https://doi.org/10.1158/0008-5472.sabcs-09-107

5. Menzies FM, Henriquez FL, Alexander J, Roberts CW. Sequential expression of macrophage anti-microbial/inflammatory and wound healing markers following innate, alternative and classical activation. 160(3):369-379. https://doi.org/10.1111/j.1365-2249.2009.04086.x