Protokół dysocjacji komórek trypsyną
Trypsyna w hodowli komórkowej
Dysocjacja komórek to proces podczas pasażowania komórek, w którym komórki są odłączane od traktowanej powierzchni w celu utworzenia zawiesin. Zawiesiny te są ważne dla ponownego wysiewu do podhodowli, liczenia komórek do analizy i rozmnażania komórek. Istnieją różne enzymy proteolityczne, które są używane do odłączania komórek od przylegającego podłoża, w tym trypsyna.
Trypsyna jest członkiem rodziny proteaz serynowych często stosowanych do odłączania komórek. Optymalna aktywność trypsyny występuje w temperaturze 37 °C, więc wstępnie ogrzana trypsyna jest często stosowana w celu przyspieszenia odrywania komórek. Jednak długotrwała inkubacja z wysokimi stężeniami trypsyny może uszkadzać komórki poprzez usuwanie białek powierzchniowych i zabijanie komórek.
Atrybuty trypsyny
Trypsyna jest tolerowana przez wiele typów komórek. Jednak w badaniach proteomicznych i eksperymentach wymagających hodowli bez surowicy często unika się stosowania trypsyny. W zależności od zastosowania i typu komórek można stosować różne składniki i stężenia trypsyny. Niektóre z atrybutów omówiono poniżej.
- EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy disodu): Cząsteczki adhezyjne w obecności wapnia określają interakcje komórka-komórka i komórka-matryca. EDTA jest często dodawany do trypsyny w celu chelatowania kationów dwuwartościowych (Ca2+, Mg 2+) i osłabienia tych interakcji.
- Czerwień fenolowa: Trypsyna ma optymalną aktywność w zakresie pH od 7 do 9. W tym zakresie czerwień fenolowa nadaje roztworowi różowy kolor. Ze względu na warunki środowiskowe pH trypsyny może stać się kwaśne, zmniejszając jej skuteczność i powodując pomarańczowy kolor. Dostosowując pH do 7,4 - 7,6 za pomocą NaOH, aktywność trypsyny może zostać przywrócona.
- Diluent: Aby pomóc utrzymać pH i równowagę osmotyczną, stężoną trypsynę można rozcieńczyć lub rozpuścić w buforowanym roztworze soli, który nie zawiera Ca2+ lub Mg2+, takim jak Zrównoważony roztwór soli Hanka . Niektóre produkty trypsyny mogą być również rozcieńczone w 0,9% NaCl.
- Źródło i forma: Głównym źródłem trypsyny jest świnia i jest ona dostępna w postaci liofilizowanego proszku lub roztworu. Aby uniknąć produktów pochodzenia zwierzęcego lub mikrobiologicznego, rekombinowana trypsyna bydlęca, Roztwór trypsyny, jest wyrażana w kukurydzy.
- Stężenie: W zależności od typu komórek i zastosowania trypsyna jest stosowana w różnych stężeniach. W przypadku silnie przylegających linii komórkowych stosuje się trypsynę o stężeniu od 2,5% do 0,25% (moc od 10X do 1X). Niższe stężenia trypsyny, takie jak 0,05%, mogą być stosowane w badaniach, które wymagają zachowania integralności białek powierzchniowych komórek.
Protokół trypsynizacji
Ten protokół jest wykonywany przy zachowaniu aseptycznego środowiska, takiego jak laminarny bio monitorowany kaptur.
- Podgrzać roztwór trypsyny, zbilansowany roztwór soli (roztwór wolny od Ca+2 i Mg+2) i pożywkę wzrostową do temperatury 37 °C
- Zbadać komórki, aby upewnić się, że są zdrowe i wolne od zanieczyszczeń
br> - Usuń i wyrzuć podłoże hodowlane z kolby
- Delikatnie przepłucz komórki zrównoważonym roztworem soli bez jonów Ca+2 i Mg+2 i usuń roztwór. Mocno przylegające komórki można również przemyć roztworem tryspiny. Jednak w przypadku wrażliwych komórek preferowany jest zrównoważony roztwór soli.
- Dodaj odpowiednią ilość (0,5 ml/10 cm2) wstępnie ogrzanego roztworu trypsyny do bocznej ściany kolby. Delikatnie wymieszaj zawartość, aby pokryć warstwę komórek.
- Inkubuj naczynie w temperaturze pokojowej przez 2-3 minuty (czas inkubacji różni się w zależności od użytej linii komórkowej). Mocno przylegające komórki można szybko oddzielić w temperaturze 37°C. Obserwuj komórki pod mikroskopem. Oderwane komórki wydają się zaokrąglone i załamują światło pod mikroskopem. Jeśli oderwanych zostanie mniej niż 90% komórek, należy inkubować kolbę przez kolejne 2 minuty i obserwować komórki pod mikroskopem co 30 sekund.
Uwaga: Zapobiegaj ekspozycji komórek na roztwór trypsyny przez dłuższy czas (=10 min)
- Gdy komórki wydają się odłączone, dodaj dwie objętości wstępnie ogrzanego kompletnego podłoża wzrostowego w celu inaktywacji trypsyny. Delikatnie rozproszyć pożywkę, kilkakrotnie uderzając pipetą o powierzchnię warstwy komórek, aby zapewnić odzyskanie 95% komórek. W przypadku hodowli bez surowicy, Inhibitor trypsyny sojowej jest dodawany w stężeniu równomolarnym w celu zahamowania trypsyny.Uwaga: Energiczne pipetowanie może spowodować uszkodzenie komórek.
- Przenieś zawiesinę komórek do probówki i delikatnie odwiruj przy 100-300g przez 5-10 min. Po usunięciu supernatantu, delikatnie zawiesić osad komórkowy w podgrzanej pełnej pożywce wzrostowej. Pobrać wymaganą próbkę w celu określenia gęstości żywych komórek za pomocą hemocytometru i błękitu trypanu wykluczenie lub automatyczny licznik komórek.
- Rozcieńczyć pozostały roztwór do gęstości wysiewu i odpipetować odpowiednią objętość do kolby hodowlanej i umieścić ją w inkubatorze.
Referencje
Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.
Nie masz konta użytkownika?