Auto2D^®自動2次元電気泳動装置

2次元電気泳動はどのようなしくみでしょうか？SDS-PAGEなどの1次元タンパク質ゲル電気泳動技術は、ラボで日常的に行われていますが、これらの方法で得られる分離能は低いです。2次元電気泳動（2-DE）は、複雑なサンプル中のタンパク質をpI値や分子量によって分離し、数百または数千のタンパク質を高い分解能で同時に直接比較できるようにします。解析ソフトウェア、免疫検出法、または質量分析技術と組み合わせることにより、2-DEはタンパク質同定やその他のプロテオーム解析に役立つ強力なツールとなります。その他の製品の詳細については、タンパク質電気泳動・ウェスタンブロッティングページをご覧ください。

• 2次元電気泳動の完全自動化
• Auto2D^® を使用して2次元電気泳動を行う方法
• 2次元電気泳動を行う理由
• バイオ医薬品の残留HCP測定
• ELISAなどのイムノアッセイの抗HCP抗体検証のための Auto2D^®システム
• Auto2D^®システムの高い再現性
• Auto2D^®システムを用いた抗原プロファイリング
• 法令遵守のためのAuto2D^®システム

 

2次元電気泳動の完全自動化

2次元電気泳動は、一般に操作が難しく時間がかかり、高度なユーザートレーニングを要する一方で再現性が低く、オペレーター間のばらつきが大きいとされてきました。Auto2D^®システムは、2次元電気泳動を完全に自動化します。アプライしたサンプルは1次元目のゲルに入り、等電点によるタンパク質の分離が行われます。平衡化した後、1次元目のゲルがSDS-PAGEゲルにセットされ、分子量によってタンパク質が分離されます。Auto2D^® 2次元電気泳動装置は使いやすく、より迅速に1～2時間で2次元電気泳動が可能となり、再現性の高い結果を出せます。Auto2D^® 2次元電気泳動装置のその他の特徴と利点を以下に示します。

• 使いやすく、高度なトレーニングは不要
• 迅速なワークフローによりラボのダウンタイムを削減
• オペレーター間のばらつきを減らして再現性を向上
• GMP適合のためのIQ/OQサポート

Auto2D^®を使用して2次元電気泳動を行う方法

Auto2D^®電気泳動装置は、2次元電気泳動を完全に自動化し、タンパク質解析を簡単にして、ユーザーに依存しない一貫性と再現性に優れた結果を提供します。Auto2D^®システムの効率的な技術により、サンプルロード、等電点電気泳動、平衡化、およびSDS-PAGEにかかる時間を、4～24時間からわずか1～2時間へと大幅に短縮します。この特徴によりAuto2D^®は、市販されている他の半自動2-DEシステムとは一線を画します。

図1. Auto2D®によって自動化された2次元電気泳動のワークフローとステップ

2次元電気泳動を行う理由

Auto2D^®2次元電気泳動装置は、数多くのアプリケーションで実証済みです。例えば、がん研究におけるタンパク質発現差異解析や疾患メカニズムの解明などがあります。その他のアプリケーションには、結晶化または翻訳後修飾解析のための精製タンパク質の分離への使用、およびアレルギー研究や細胞シグナル伝達経路の解析などの研究における2-Dウェスタンブロッティングなどがあります。

図2. 左：がんバイオマーカー研究のための培養細胞におけるタンパク質発現差異解析。緑色は正常細胞でより豊富なタンパク質を示す。赤色はがんに特異的なタンパク質スポットを示す。黄色はタンパク質発現の重複を示す。右：血漿サンプル中のタンパク質発現差異。

図3. 左：治療用抗体製剤の微小不均一性の評価。赤色の三角はターゲット抗体のスポットを示し、下にあるスポットは領域欠損のある抗体。右：精製前後のタンパク質解析。2-DEは、結晶化およびX線構造解析に用いるサンプルが均質かどうかを確認するために使用できる。

図4. 小麦の抽出タンパク質のSDS-PAGE（SYPRO Rubyにより検出）（A）、WB：Anti-Gliadin antibody （B）、およびマージ（C）。小麦の抽出タンパク質（SYPRO Rubyにより検出）、矢印はAnti-Gliadin antibodyによって検出されたスポットを示す（D）。WB： Anti-Gliadin antibody（E）、およびマージ（F）。

バイオ医薬品の残留HCP測定

2次元電気泳動は、治療用のタンパク質と抗体のバイオプロセスにおける残留宿主細胞由来タンパク質（HCP）解析にも適します。バイオ医薬品の製造プロセスで混入する残留HCP不純物は、患者の免疫応答を引き起こし、薬効を低下させるおそれがあります。法令遵守においては、HCPをモニタリングし、安全性を確保できる低いレベルまでHCPを除去することが求められています。日本、欧州、および米国の薬局方は、バイオ医薬品製造のためのHCPアッセイの開発およびバリデーションに関するガイドラインを公表しています。

法令遵守のためには、すべてのアッセイ構成品を厳格に適格性認定し、体系的にHCPアッセイを開発しなければなりません。抗体の検証では、2次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（2D-PAGE）により、包括的にHCPカバレッジを確認する必要があります。2D-PAGEなどのゲル電気泳動法は、ポリクローナル抗体産生のための免疫原や標準タンパク質として使用される抗原の特性解析にも推奨される方法です。Auto2D^®2次元電気泳動装置は、高度なユーザートレーニングを必要とせず、業界スタンダードに適合するバイオプロセスワークフローへの組み込みが容易です。

ELISAなどのイムノアッセイの抗HCP抗体検証のためのAuto2D^®システム

ELISAは、HCP解析において最も一般的なアッセイフォーマットです。このイムノアッセイ法は、残留HCPを幅広く認識するポリクローナル抗体を使用しています。日本と欧州の薬局方では、HCP抗体のカバレッジを評価するために、2次元電気泳動後にウェスタンブロット解析（2-Dウェスタンブロッティング）を行うよう指定しています。米国の薬局方は、抗体カバレッジを評価するために、2-Dウェスタンブロッティングまたはイムノアフィニティ精製後にゲル電気泳動を行うよう指定しています。

図5. 市販のCy3標識CHO HCP抗原20 μgを、pH 3-10 IEFチップおよび12.5% PAGEチップを用いて、Auto2D^®システムで2次元電気泳動した（A）。さらに、タンパク質をメンブレンにトランスファーし、2種類の抗HCP抗体を用いてウェスタンブロッティングした（B、C）。データは、抗HCP抗体2よりも抗HCP抗体1のほうが宿主細胞タンパク質のカバレッジが広いことを示している。

Auto2D^®システムの高い再現性

バイオ医薬品の製造と品質管理には、一貫性と再現性に優れたプロセスが不可欠です。完全自動化のAuto2D^®電気泳動システムは、より迅速な結果とより高いスループットをもたらすとともに、2D-PAGE法や2D-DIGE法に見られる日差変動やオペレーター間のばらつきを解消して、より信頼性の高い結果を非常に優れた再現性で提供します。

図6. 市販のCy5標識CHO HCP抗原0.75 μgを、IEF Chip pH 3-10NLおよびPAGE Chip 12.5%を用いて、Auto2D^®システムで2次元電気泳動した。同じサンプルを合計3回測定（A～C）。白いスポット（D）は結果の重複を表す。データは、Auto2D^®システムを用いた2次元電気泳動の高い再現性を示唆している。

Auto2D^®システムを用いた抗原プロファイリング

ELISAなどのイムノアッセイのためのポリクローナル抗体を得るには、HCP抗原による免疫が必要です。HCP抗原は、検出と定量のための標準タンパク質としても使用されます。プロセスに特異的なHCP抗原は、非トランスフェクションのnull細胞を用いて生成されます。これらの抗原がHCPのパターンと広範囲のタンパク質の存在を示し、またnull細胞由来のHCP抗原が生産細胞の抗原を代表することを実証するために特性評価を行う必要があります。日本、欧州、および米国の薬局方は、抗原の特性評価およびプロファイリングにSDS-PAGEまたは2次元電気泳動の使用を推奨しています。また、米国の薬局方では、残留HCPモニタリングの補足法としても2次元電気泳動の使用を推奨しています。

図7. Cy3標識未精製CHO HCP抗原とCy5標識Protein A精製CHO HCP抗原の混合液を、Auto2D^®システムを用いて蛍光ディファレンスゲル電気泳動（2D-DIGE）で解析した（A～B）。マージデータ（C）の赤色のスポットは、Protein A精製後も残留しやすい宿主細胞タンパク質を表す。これらのデータは、Auto2D^®システムが精製後に残留している宿主細胞タンパク質成分のプロファイリングに使用できることを実証している。

法令遵守のためのAuto2D^®システム

Auto2D^®システムは、バイオ医薬品製造におけるHCP解析のための規制要件の適合に役立ちます。この完全自動化システムにより、日差変動やオペレーター間のばらつきが解消され、信頼性の高い結果を2時間以内に得ることができます。Auto2D^®システムは、バイオプロセスワークフローへの組み込みが容易で、生産変更に伴うラボのダウンタイムを削減します。外部委託の必要がなく、HCP解析に社内リソースを使用し、知的財産を保護できます。製品やリソースの詳細については、タンパク質電気泳動・ウェスタンブロッティングのページをご覧ください。