ELISAプロトコル

• ・サンドイッチアッセイの手順
• ・リン酸化アッセイの手順
• ・EIAアッセイの手順
• ・細胞ベースアッセイの手順

サンドイッチアッセイの手順

1. 使用前にすべての試薬およびサンプルを室温（18～25℃）に戻します。スタンダードおよびサンプルはすべて、少なくともデュプリケートで行うことをお勧めします。
2. スタンダードおよびサンプルを100 µLずつ適切なウェルに添加します。ウェルにカバーをし、室温で2.5時間または4℃で一晩、穏やかに振盪しながらインキュベートします。
3. 溶液を捨て、1X Wash Solutionで4回洗浄します。マルチチャネルピペットまたはウォッシャーを用いて各ウェルをWash Buffer（300 µL）で洗浄します。分析性能を良くするには各ステップで完全に溶液を除去することが不可欠です。最終洗浄後、余分なWash Bufferを吸引またはデカンタで除去します。プレートを裏返し、清潔なペーパータオルに当てて水分を吸い取ります。
4. 調製した1x Detection Antibody 100 µLを各ウェルに添加します。ウェルにカバーをし、室温で穏やかに振盪しながら1時間インキュベートします。
5. 溶液を捨てます。ステップ3の洗浄手順を再度行います。
6. 調製したStreptavidin solution 100 µLを各ウェルに添加します。ウェルにカバーをし、室温で穏やかに振盪しながら45分間インキュベートします。
7. 溶液を捨てます。ステップ3の洗浄手順を再度行います。
8. TMB One-Step Substrate Reagent（Item H）100 µLを各ウェルに添加します。ウェルにカバーをし、暗所にて室温で穏やかに振盪しながら30分間インキュベートします。
9. Stop Solution（Item I）50 µLを各ウェルに添加します。直ちに450 nmの吸光度を読み取ります。

・リン酸化アッセイの手順

1. 使用前にすべての試薬を室温（18～25℃）に戻します。サンプルまたはポジティブコントロールはすべて、少なくともデュプリケートで行うことをお勧めします。
2. 各サンプルまたはポジティブコントロールを100 µLずつ適切なウェルに添加します。ウェルにカバーをし、室温で2.5時間または4℃で一晩、振盪しながらインキュベートします。
3. 溶液を捨て、1x Wash Solutionで4回洗浄します。マルチチャネルピペットまたはウォッシャーを用いて各ウェルをWash Buffer（300 µL）で洗浄します。分析性能を良くするには各ステップで完全に溶液を除去することが不可欠です。最終洗浄後、余分なWash Bufferを吸引して除去します。プレートを裏返し、清潔なペーパータオルに当てて水分を吸い取ります。
4. 調製した1X biotinylated anti-phosphotyrosine antibody 100 µLを各ウェルに添加します。室温で振盪しながら1時間インキュベートします。
5. 溶液を捨てます。ステップ3の洗浄手順を再度行います。
6. 調製した1X HRP-Streptavidin solution 100 µL（「試薬調製」ステップ6を参照）を各ウェルに添加します。室温で振盪しながら45分間インキュベートします。
7. 溶液を捨てます。ステップ3の洗浄手順を再度行います。
8. TMB One-Step Substrate Reagent（Item H）100 µLを各ウェルに添加します。暗所にて室温で振盪しながら30分間インキュベートします。
9. Stop Solution（Item I）50 µLを各ウェルに添加します。直ちに450 nmの吸光度を読み取ります。

EIAアッセイの手順

1. 試薬調製ステップの間、キット試薬を氷上に置きます。スタンダードおよびサンプルはすべて、少なくともデュプリケートで行うことをお勧めします。
2. anti-“target” antibody 100 µLを各ウェルに添加します。室温で穏やかに振盪（1～2サイクル／秒）しながら1.5時間インキュベートします。4℃で一晩インキュベートすることもできます。
3. 溶液を捨て、1x Wash Bufferで4回洗浄（各回200～300 µL）します。マルチチャネルピペットまたはウォッシャーを用いて洗浄することもできます。分析性能を良くするには各ステップで完全に溶液を除去することが不可欠です。最終洗浄後、余分なWash Bufferを吸引またはデカンタで除去します。プレートを裏返し、清潔なペーパータオルに当てて水分を吸い取ります。
4. スタンダード、ポジティブコントロール、およびサンプル各100 µLを適切なウェルに添加します。blankのウェル（Assay Diluentのみ）も忘れずに用意してください。ウェルにカバーをし、穏やかに振盪（1～2サイクル／秒）しながら室温で2.5時間または4℃で一晩インキュベートします。
5. 溶液を捨て、ステップ3の指示どおりに洗浄を4回行います。
6. 調製したHRP-Streptavidin solution 100 µLを各ウェルに添加します。室温で穏やかに振盪しながら45分間インキュベートします。インキュベーションの時間を45分間よりも短縮・延長しないことを推奨します。
7. 溶液を捨て、ステップ3の指示どおりに洗浄を4回行います。
8. TMB One-Step Substrate Reagent（Item H）100 µLを各ウェルに添加します。暗所にて室温で穏やかに振盪（1～2サイクル／秒）しながら30分間インキュベートします。
9. Stop Solution（Item I）50 µLを各ウェルに添加します。直ちに450 nmの吸光度を読み取ります。

・細胞ベースアッセイの手順

注記：インキュベーションおよび洗浄ステップはすべて、穏やかに振盪またはローテーション（約1～2サイクル／秒）しながら行うこと。

1. 実験デザインを決める。
   オプション：HUVEC、HMEC‐1、またはその他の接着が弱い細胞を播種する場合、Uncoated 96‐Well Microplate（ITEM A）にpoly‐L‐Lysine（Sigma-Aldrich製品番号P4832を推奨）100 µLを各ウェルに添加してコーティングしてから、メーカーのマニュアルに従って進めてください。コーティング済みのCellBIND^® マイクロプレートまたはその他のpoly‐lysine処理組織培養プレートをITEM Aの代わりに使うこともできます。
2. 100 µLの細胞（10,000～30,000細胞）を Uncoated 96‐ Well Microplate（ITEM A）の各ウェルに播種し、37℃、5%CO₂で一晩インキュベートします。
   注記：最適な細胞数は細胞株およびタンパク質リン酸化の相対量によって変わります。細胞数を増減することもできますが、実験に基づいて決定しなければなりません。注記：阻害剤または活性化剤で処理する前に細胞を約4～24時間（細胞株による）飢餓状態にしてもよいです。         
3. メーカーのマニュアルに従って阻害剤（siRNAまたは化学物質等）または活性化剤等でさまざまな処理を行い、所定の時間インキュベートします。 
   注記：細胞処理の前に阻害剤または活性化剤を血清フリー細胞培養液に溶かすことをお勧めします（メーカーのマニュアルに記載がない限り）。       
4. マイクロプレートを裏返し、シンクの上でプレートの底を軽く叩き、細胞培養液を除去します。
5. 調製した1X Wash Buffer A（ITEM B）200 µLをピペットで各ウェルに添加し、洗浄します。を捨て（ステップ4と同様）、さらに2回洗浄して計3回洗浄します。各回とも新しいを使用します。最終洗浄後、清潔なペーパータオルにマイクロプレートを優しく当てて余分な／残ったバッファーを除去します。
   注記：細胞をロスしないように、細胞に直接ピペッティングしないでください。代わりに、細胞培養ウェルの壁を伝わせて優しく溶液を加えてください。溶液を除去する際に真空吸引したり、マイクロプレートを強く叩いたりするのはやめてください。       
6. Fixing Solution（ITEM D）100µLを各ウェルに添加し、室温で20分間インキュベートします。
   注記：fixing solutionは細胞の浸透性を高めるために使用します。  
7. 洗浄ステップ5を再度行います。
8. 調製した1X Quenching Buffer（ITEM E）200 µLを各ウェルに添加し、室温で20分間インキュベートします。
   注記：quenching bufferはバックグラウンドの反応を最小化するために用います。  
9. 1X Wash Buffer Aで4回洗浄します。
10. 調製した1X Blocking Buffer（ITEM F）200 µLを各ウェルに添加し、37℃で1時間インキュベートします。 
    
11. 調製した1X Wash BufferB（ITEM C）で3回洗浄します。
    注記：必要であれば、この洗浄後にマイクロプレートを−80℃で数日間保管することも可能です。
12. 調製した1X primary antibody （ITEM G‐1、G‐2、G‐3、H‐1、H‐2、またはH‐3）50 µLを相応するウェルのそれぞれに添加し、室温で2時間インキュベートします。
13. 1X Wash Buffer Bで4回洗浄します。
14. 調製した1X HRP Conjugated secondary antibody （ITEM I‐2）50µLを各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートします。
15. ステップ13を再度行います。
16. TMB Substrate（ITEM J）100µLを各ウェルに添加し、暗所にて室温で30分間インキュベートします。
17. Stop Solution （ITEM K）50 µLを各ウェルに添加します。直ちに450 nmの吸光度を読み取ります。

上記プロトコルはガイドラインとしてのみ使用できます。詳しくは各キットの技術情報をご参照ください。