Oczyszczanie i zatężanie analitów śladowych ze złożonych matryc za pomocą końcówek do pipet ZipTip^® Micro-SPE

• Przygotowanie próbki za pomocą końcówek mikropipet ZipTip^®./a>
• Oczyszczanie oligonukleotydów do analizy MALDI.
• Oczyszczanie poli-L-ornityny do analizy MALDI
• Ogólny protokół oczyszczania mAb, nietoksycznych ADC i innych koniugatów mAb do analizy MALDI
• Wybór publikacji dotyczących końcówek mikropipet ZipTip^®

 

Przygotowanie próbek za pomocą końcówek mikropipet ZipTip^®

• Próbki do analizy spektrometrii mas (MS) muszą być odpowiednio oczyszczone i skoncentrowane, aby uzyskać optymalne wyniki.
• MALDI-TOF MS służy do analizy nienaruszonych dużych cząsteczek, takich jak białka, przeciwciała monoklonalne, peptydy, oligonukleotydy i polimery.
• Nano LC-MS oferuje doskonałą czułość dla małych objętości rozcieńczonych próbek. Jest używany w badaniach omicznych i innych zastosowaniach, w których próbka, taka jak płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF), jest ograniczona.
• Końcówki do mikropipet ZipTip^® to końcówki do pipet o pojemności 10 μL z zamocowanym na końcu złożem chromatograficznym o mikroobjętości. Są one przeznaczone do oczyszczania i zatężania białek i peptydów, oligonukleotydów i polimerów w ilościach od femtomoli do pikomoli, zapewniając lepsze dane specyfikacji masowej.
• Końcówki do mikropipet ZipTip^® są dostępne w żywicach C18, C4 i silnie kationowych (SCX), ze złożem 0,6 lub 0,2 µl.2 µL.
  • C18 jest szeroko stosowana w analizie peptydów / trawieniu białek
  • C4 jest zalecana do dużych cząsteczek
  • SCX działa szczególnie dobrze w przypadku peptydów tryptycznych, które mają co najmniej dwa ładunki dodatnie na cząsteczkę przy kwaśnym pH

Końcówki do mikropipet ZipTip^®

Objętość złoża	Sorbent
	C18	C4	SCX
0.6 µL	ZTC18S	ZTC04S	ZTSCXS
0.2 µL	ZTC18M	----	----

Oczyszczanie oligonukleotydów do analizy MALDI

Ten protokół wykorzystuje końcówki mikropipet ZipTip^®  końcówek mikropipet z żywicą C18 do oczyszczania próbek oligonukleotydów przed analizą MALDI. Użyj 100 - 200 ng próbki oligonukleotydu do oczyszczenia.

ZipTip^® Cleanup

1. Rozcieńczyć próbkę do końcowej objętości 10 µL w 0,1 M TEAA.
2. Podłącz końcówkę ZipTip^® (C18) do odpowiedniej pipety, ustawionej na maksymalną objętość 10 µL.
3. Zaparuj końcówkę mikropipety ZipTip^® poprzez wciśnięcie tłoka pipety do oporu. Zassać 50% acetonitrylu (ACN) w dH₂O do końcówki, odmierzyć do odpadów i powtórzyć.
4. Wyrównać końcówkę ZipTip^® przemywając ją 3x 10 µL 0.1 M TEAA.
5. Wiąż próbkę z końcówką ZipTip^® naciskając tłok pipetora do oporu. Umieść końcówkę w próbce i wykonaj cykl zasysania i dozowania 5 - 10 razy.
6. Przepłucz końcówkę ZipTip^® 3x 10 µL świeżego 0,1 M TEAA, dozując do odpadów po każdym cyklu zasysania i dozowania.
7. Umyć końcówkę ZipTip^® 3x 10 µL dH₂O, dozując do odpadów po każdym cyklu aspiracji i dozowania.
8. Dozować od 1 do 10 µl 50% ACN w dH₂O do czystej probówki mikrowirówkowej za pomocą standardowej końcówki pipety. Im większa użyta objętość, tym lepszy odzysk (kosztem stężenia).

UWAGA: Jeśli stężenie próbki jest niepokojące, dozuj próbkę do przygotowanej matrycy zamiast 50% ACN. Pozwoli to uniknąć dalszego rozcieńczania, które występuje podczas mieszania z matrycą po elucji. 

1. Aspiruj i dozuj eluent przez końcówkę pipety ZipTip^® co najmniej 3 razy bez wprowadzania powietrza.

Przygotowanie próbki/celu MALDI

1. Wymieszać matrycę i próbki w stosunku 1:1.
2. Nanieść 1 µL próbki 3x na cel MALDI i pozostawić do wyschnięcia. 

.

Oczyszczanie poli-L-ornityny do analizy MALDI

Poli-L-ornityna jest szeroko stosowana do powlekania plastikowych i szklanych powierzchni w celu zwiększenia przyczepności komórek. PEGylowana poli-L-ornityna jest również stosowana w dostarczaniu leków. Poniższa metoda wykorzystuje końcówki mikropipet ZipTip^® C4 jako część testów stabilności poli-L-ornityny; były one używane do usuwania soli przed analizą MALDI-TOF MS.

Rekonstytucja i inkubacja poli-L-ornityny

1. Rozpuścić poli-L-ornitynę w 0.9% roztworze soli fizjologicznej w stężeniu 1 mg/ml (mieszając przy 300 obr./min przez 15 min).
2. Utworzyć siedem podwielokrotności 100 µL i przechowywać w temperaturze -20°C do czasu inkubacji.
3. Inkubację przeprowadza się w następujący sposób:
   1. Siedemdziesiąt dwie godziny przed analizą rozmrozić dwie podwielokrotności. Umieść jedną podwielokrotność w inkubatorze ustawionym na 25°C, a drugą podwielokrotność w inkubatorze ustawionym na 40°C.
   2. Dwadzieścia cztery godziny przed analizą rozmroź dwie podwielokrotności. Umieść jedną podwielokrotność w inkubatorze ustawionym na 25°C, a drugą podwielokrotność w inkubatorze ustawionym na 40°C.
   3. Osiem godzin przed analizą rozmroź dwie podwielokrotności. Umieść jedną podwielokrotność w inkubatorze ustawionym na 25°C, a drugą podwielokrotność w inkubatorze ustawionym na 40°C.
   4. W czasie analizy rozmroź jedną podwielokrotność, aby użyć jej jako próbki kontrolnej.

ZipTip^® Cleanup

1. Umieść 10 µL każdej próbki w oddzielnej probówce do mikrowirówki.
2. Zwilż końcówkę mikropipety ZipTip^® (C4) przez 3-krotne zaaspirowanie acetonitrylu, a następnie usuń do odpadów.
3. Rozluźnij końcówkę mikropipety ZipTip^® poprzez 3-krotne zassanie wody destylowanej, a następnie wyrzuć ją do odpadów.
4. Zasysaj 10 µL objętości próbki do końcówki mikropipety ZipTip^® i wykonaj cykl 10 razy, a następnie wyrzuć ją do odpadów.
5. Umyj końcówkę mikropipety ZipTip^® poprzez 5-krotne zassanie wody destylowanej, a następnie usuń ją do odpadów.
6. Umieść 10 µL 50% acetonitrylu/50% wody destylowanej w czystych probówkach do mikrowirówki (jedna probówka na każdą próbkę). Użyj roztworu do zasysania i dozowania eluentu przez końcówkę mikropipety ZipTip^®; wykonaj cykl dziesięć razy.

Analiza MALDI-TOF

A.      Przygotowanie roztworu - standardy przydatności systemu

1. Przygotować objętość kwasu α-cyjano-4-hydroksycynamonowego o stężeniu 10 mg/ml w 50% acetonitrylu/0.05% kwasu trifluorooctowego w wodzie destylowanej.
2. Przygotować utleniony łańcuch β insuliny, insulinę, cytochrom C i apomioglobinę w stężeniu 10 pmol/µL w odpowiednim roztworze.
   1. Utleniony łańcuch β insuliny rozpuścić w 50% acetonitrylu/0,05% kwasie trifluorooctowym w wodzie destylowanej.
   2. Utlenioną insulinę rozpuścić w 1,0% kwasie trifluorooctowym w wodzie destylowanej.
   3. Wszystkie pozostałe wzorce rozpuścić w 0,1% kwasie trifluorooctowym w wodzie destylowanej.1% kwasie trifluorooctowym w wodzie destylowanej.
3. Zmieszaj roztwory kalibrantów w stosunku 1:1 (v:v) z przygotowanym roztworem kwasu α-cyjano-4-hydroksycynamonowego o stężeniu 10 mg/ml, nanieś na tarczę MALDI i pozostaw do wyschnięcia. Wymieszać matrycę i próbki w stosunku 1:1.
   1. Dla próbek poli-L-ornityny o masie cząsteczkowej 5 000 - 11 000 Da należy użyć mieszaniny 1:3:9 (v:v) utlenionego łańcucha β insuliny:insuliny:cytochromu C jako kalibratora.
   2. Dla próbek poli-L-ornityny o masie cząsteczkowej 11 000 - 17 000 Da należy użyć mieszaniny insulina:cytochrom:apomyoglobina w stosunku 1:3:9 (v:v) jako kalibratora.
   3. Użyte proporcje kalibratorów mogą ulec zmianie w razie potrzeby, aby zapewnić zwiększoną jonizację wzorców o większej masie cząsteczkowej.

B.     Przygotowanie roztworu - Poli-L-Ornityna

1. Przygotować drugą objętość kwasu α-cyjano-4-hydroksycynamonowego o stężeniu 3.8 mg/ml w metanolu.
2. Zmieszać odsolone próbki w stosunku objętościowym 1:1 z przygotowanym kwasem α-cyjano-4-hydroksycynamonowym o stężeniu 3,8 mg/ml i umieścić na tarczy MALDI w trzech egzemplarzach.
3. 3Suszyć próbki na tarczy i umieścić w instrumencie MALDI-TOF do analizy.

C.      Przydatność systemu

1. Kalibracja przyrządu przy użyciu odpowiedniej mieszaniny kalibracyjnej.
2. Weryfikuj przydatność systemu analizując błąd masy cząsteczkowej cytochromu C.

D.    Analiza próbki

1. Użyj ustawień instrumentalnych MALDI-TOF zwykle używanych do analizy poli-L-lizyny w celu sprawdzenia przydatności z poli-L-ornityną (poli-L-lizyna ma podobny rozmiar i skład do poli-L-ornityny).
2. Dostosuj parametry instrumentalne zgodnie z wymaganiami, aby uzyskać widma wysokiej jakości.
3. Po zoptymalizowaniu parametrów instrumentalnych, przeanalizuj trzy plamki próbki z każdego punktu czasowego. 

.

Ogólny protokół oczyszczania przeciwciał monoklonalnych, nietoksycznych ADC i innych koniugatów mAb do analizy MALDI

ZipTip^® z żywicą C4 jest zalecany do białek o masie cząsteczkowej >100 kDa, co czyni je idealnymi do oczyszczania przeciwciał monoklonalnych.

1. Umieść 10 µL każdej próbki w oddzielnej probówce do mikrowirówki.
2. Zwilż końcówkę mikropipety ZipTip^® (C4) przez 3-krotną aspirację acetonitrylu, z usunięciem do odpadów.
3. Rozluźnij końcówkę mikropipety ZipTip^® przez 3-krotne zassanie wody destylowanej, a następnie wyrzuć ją do odpadów.
4. Zasysaj 10 µL próbki do końcówki mikropipety ZipTip^® i wykonaj cykl 10 razy, a następnie wyrzuć ją do odpadów.
5. Umyj końcówkę mikropipety ZipTip^® przez 5-krotne zassanie wody destylowanej, a następnie usuń ją do odpadów.
6. Umieść 10 µL 50% ACN z 0,05% TFA w wodzie w czystych probówkach mikrowirówkowych (jedna probówka na każdą próbkę). Użyj roztworu do zasysania i dozowania eluentu przez końcówkę mikropipety ZipTip^®; wykonaj cykl dziesięć razy. 

UWAGI:

• Jeśli stężenie próbki jest problemem, dozuj próbkę do przygotowanej matrycy (zamiast 50% ACN z 0.05% TFA w wodzie), ponieważ cząsteczki te wymagają wyższego stężenia do prawidłowej jonizacji ze względu na ich duży rozmiar.
• Kwas sinokapowy jest używany do matrycy.  

Wybrane publikacje dotyczące końcówek mikropipet ZipTip^®

Rok	Tytuł (Dziennik)	Próbka	Żywica ZipTip®	Analiza downstream
2023	Analiza fenotypowej heterogeniczności APC-Mutant Colon Cancer za pomocą proteomiki i fosfoproteomiki identyfikuje RAI14 jako kluczowy czynnik prognostyczny u Azjatów ze Wschodu i ludzi z Zachodu (Molecular and Cellular Proteomics) https://doi.org/10.1016/j.mcpro.2023.100532	Rak jelita grubego	C18	Nano LC-MS
2023	Proteotypowe peptydy sierści do identyfikacji pospolitych europejskich gatunków zwierząt domowych i dzikich ujawnione przez trawienie białek w próbce i analizę spektrometrii mas (J of Separation Science) https://doi.org/10.1002/jssc.202300064	Sierść zwierząt	C18	MALDI-TOF MS
2023	Glycomics-Assisted Glycoproteomics Enables Deep and Unbiased N-Glycoproteome Profiling of Complex Biological Specimens https://link.springer.com/protocol/10.1007/978-1-0716-2978-9_16	Serum Plazma .	C18	Nano LC-MS
2023	Quantification of Serum Metabolites in Early Colorectal Adenomas Using Isobaric Labeling Mass Spectrometry https://doi.org/10.1021/acs.jproteome.3c00006	Serum	SCX	Nano LC-MS
2023	Zmiany wzorców białkowo-peptydowych w surowicy u dzieci atopowych uczulonych na roślinne białka magazynowe https://doi.org/10.3390/ijms24021804	Serum	C18	MALDI-TOF MS
2023	Profil proteomiczny zdrowego ludzkiego łożyska https://doi.org/10.1186/s12014-022-09388-4	Placenta	C18	Nano LC-MS
2023	Oczyszczanie i ocena aktywności nowych peptydów przeciwzapalnych z hydrolizatów ostrygi perłowej (Pinctada martensii) https://doi.org/10.1039/D2FO04046H	Ostrygi perłowe	C18	Nano LC-MS
2022	Profil proteomiczny surowicy matek z cukrzycą typu 1 https://doi.org/10.1038/s41598-022-12221-5	Serum	C18	MALDI-TOF MS Nano LC-MS
2022	A subtractive proteomics approach for the identification of immunodominant Acinetobacter baumannii vaccine candidate proteins https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.1001633	Hodowla bakteryjna	C18	Nano LC-MS
2022	Using Activity-Based Proteomics for the Quantification of Deubiquitinases in Animal Tissue https://doi.org/10.1007/978-1-0716-2803-4_4	Tkanki zwierzęce .	C18	Mass Spec
2022<	Phosphotyrosine Profiling Using SILAC https://doi.org/10.1007/978-1-0716-2863-8_9	Hodowla komórkowa	C18	Mass Spec
2022	Skład i obfitość białek powierzchniowych jelita środkowego u azjatyckiego psyllida cytrusowego, Diaphorina citri https://doi.org/10.1016/j.jprot.2022.104580	Owad	C18	timsTOF
2022	Whole Shotgun Proteomics and Its Role in Mycoremediation https://doi.org/10.1007/978-1-0716-2006-9_16	Grzyby (Mycellium)	C18	Nano LC-MS
2022	Zależna od przeciwciał modulacja odpowiedzi na wzrost neurytów w urazach rdzenia kręgowego https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.882830	Rdzeń kręgowy	C18	Nano LC-MS
2021	Proteomic Profiling of Cerebrospinal Fluid by 16-Plex TMT-Based Mass Spectrometry https://doi.org/10.1007/978-1-0716-1936-0_3	CSF	C18	Nano LC-MS
2021	Precise Characterization of KRAS4B Proteoforms by Combining Immunoprecipitation with Top-Down Mass Spectrometry https://doi.org/10.1007/978-1-0716-1190-6_3	Izoformy białka RAS	C4	Nano LC-MS
2021	Podejście proteomiczne do charakterystyki ograniczonej hydrolizy koncentratu białek serwatkowych https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2021.129235	Koncentrat białka serwatkowego	C18	MALDI-TOF MS
2021	Profilowanie proteomu ściany komórkowej szczepu Candida albicans opornego na flukonazol od pacjenta libańskiego szpitala przy użyciu tandemowej spektrometrii mas - badanie pilotażowe https://doi.org/10.3390/microorganisms9061161	Hodowla grzybów	C18	MALDI-TOF MS
2021	Mass spectrometry-based top-down and bottom-up approaches for proteomic analysis of the Moroccan Buthus occitanus scorpion venom https://doi.org/10.1002/2211-5463.13143	Jad skorpiona	C4	Nano LC-MS