Spektrometria masowa białek
Spektrometria masowa białek jest szeroko stosowana do analizy próbek biologicznych w celu odkrywania biomarkerów, badań proteomicznych i zastosowań klinicznych. W porównaniu z innymi technikami stosowanymi do charakteryzowania białek na dużą skalę, spektrometria mas stała się głównym narzędziem proteomiki w oparciu o jej podatność na złożoną analizę.
Spektrometria mas jest wykorzystywana do ilościowej identyfikacji i charakteryzowania białek w oparciu o ich strukturę, modyfikacje potranslacyjne i interakcje.
- Identyfikacja białek zazwyczaj obejmuje chemiczne lub enzymatyczne trawienie białek do peptydów, które są następnie analizowane za pomocą spektrometrii mas i identyfikowane przy użyciu metod obliczeniowych lub sekwencjonowania.
- Modyfikacje potranslacyjne można zidentyfikować poprzez zmiany masy reszt aminokwasowych. Miejsca modyfikacji mogą być mapowane za pomocą sekwencjonowania lub metod obliczeniowych.
- Do analizy i profilowania glikanów stosuje się metody enzymatyczne lub chemiczne w celu uwolnienia cząsteczek glikanu z glikoprotein, a następnie derywatyzację uwolnionych glikanów do analizy masowej.
- Interakcje białkowe są określane przez współczyszczenie powinowactwa określonego białka docelowego z dowolnymi białkami wchodzącymi w interakcje lub badane bardziej globalnie przy użyciu chromatografii wykluczania wielkości lub wymiany jonowej przed analizą za pomocą spektrometrii mas.
W przypadku proteomiki ilościowej, białka lub peptydy mogą być znakowane chemicznie stabilnymi izotopami przy użyciu tandemowego znakowania masowego (TMT) i iTRAQ lub metabolicznie poprzez włączenie znakowanych aminokwasów (SILAC). Porównanie inkorporacji ciężkich i lekkich izotopów umożliwia względną kwantyfikację poprzez skorelowanie intensywności pików spektroskopii masowej z liczebnością białek. W celu uzyskania bezwzględnej kwantyfikacji, próbki mogą być wzbogacane izotopowo znakowanymi syntetycznymi peptydami lub wzorcami białek do wybranej analizy monitorowania reakcji (SRM)
W spektrometrii masowej białek, masy różnych białek i peptydów są określane poprzez pomiar stosunku m/z (masy do ładunku) ich jonów w fazie gazowej. Spektrometry mas najpierw przekształcają cząsteczki białka w jony w fazie gazowej za pomocą źródła jonów. Następnie analizator mas oddziela zjonizowane anality na podstawie stosunku m/z. Następnie detektor rejestruje liczbę jonów przy każdej wartości m/z. Do jonizacji peptydów lub białek powszechnie stosuje się jonizację MALDI i elektrorozpylanie (ESI).
MALDI-TOF Mass Spectrometry
MALDI to metoda jonizacji, która wykorzystuje matrycę pochłaniającą energię lasera do generowania jonów przy minimalnej fragmentacji cząsteczek białka. Próbka jest najpierw mieszana z odpowiednim materiałem matrycy. Następnie impulsowy laser naświetla próbkę, wyzwalając ablację i desorpcję zarówno próbki, jak i materiału matrycy. Cząsteczki analitu są następnie jonizowane przez protonację lub deprotonację w ablowanych gazach przed analizą za pomocą spektrometrii mas.
Spektrometria masowa z jonizacją elektrorozpryskową
Jonizacja elektrorozpryskowa (ESI) wytwarza jony za pomocą elektrorozpylania, w którym wysokie napięcie jest przykładane do ciekłej próbki w celu wytworzenia aerozolu, generując jony o minimalnej fragmentacji peptydów i białek. Jonizacja elektrorozpryskowa jest powszechnie stosowana podczas łączenia spektrometrii mas z chromatografią cieczową (LC-MS), ponieważ eluat z chromatografii cieczowej może być podawany bezpośrednio do elektrorozpylania w celu przetwarzania tandemowego.
Przepływ pracy
Trawienie i etykietowanie
Swoiste proteazy, takie jak trypsyna, są używane do rozszczepiania białek na małe fragmenty, aby umożliwić identyfikację poprzez dopasowanie widm eksperymentalnych do widm teoretycznych z baz danych białek lub porównanie do standardów przebiegu. W celu względnego oznaczenia ilościowego, hodowle komórkowe mogą być znakowane metabolicznie przy użyciu stabilnych izotopów włączonych poprzez podawanie aminokwasów lub próbki mogą być znakowane stabilnymi izotopami przy użyciu metod chemicznych. Oznaczanie próbek syntetycznymi peptydami znakowanymi izotopowo pozwala na absolutną kwantyfikację poprzez analizę monitorowania wybranych reakcji (SRM).
Kalibracja i standaryzacja w specyfikacji masowej białek
Wzorce kalibracyjne mogą służyć jako kontrole do analizy próbek i być wykorzystywane do określania tożsamości białek, czułości eksperymentalnej, wydajności trawienia oraz pomocy w separacji chromatograficznej i analizie ilościowej.
Separacja chromatograficzna
Chromatografia umożliwia rozdzielenie białek i peptydów na łatwiejsze do analizy próbki. Ponieważ wiele różnych peptydów może mieć podobne masy, HPLC jest powszechnie stosowana w celu zapobiegania jednoczesnemu dodawaniu peptydów o bardzo podobnych lub identycznych masach do spektrometru masowego, zwiększając ogólny zakres dynamiczny pomiarów.
Wykrywanie i analiza
Białka i peptydy są jonizowane przez MALDI lub ESI przed wykryciem i analizą. Analizator masy rozróżnia jony na podstawie ich wartości m/z. Uzyskane wzorce fragmentacji można wykorzystać do identyfikacji, a próbki można określić ilościowo względnie, oceniając stosunki intensywności pików z próbek zróżnicowanych przez znakowanie izotopowe lub ilościowo absolutnie przy użyciu analizy SRM ze znakowanymi wzorcami wewnętrznymi.
Odwiedź naszą wyszukiwarkę dokumentów, aby znaleźć arkusze danych, certyfikaty i dokumentację techniczną.
Powiązane artykuły
- Dowiedz się więcej o spektrometrii mas lub MS, w tym o tym, czym jest, do czego służy i jak działa.
- Absolute Quantification (Protein-AQUA™™) is a targeted quantitative proteomics technique that exhibits robust efficacy and is being increasingly utilized for a wide variety of quantitative proteomics studies.
- Utilize the protein AQUA™ technique to measure expression of silenced genes, quantitate protein levels for low abundance serum proteins and analyze phosphorylated peptides enriched with immobilized metal affinity chromatography.
- Standardize Your Research. We offer both the Universal Proteomics Standard and the Proteomics Dynamic range Standard as complex, well-defined, well characterized reference standards for mass spectrometry.
- Zestaw do szybkiego trawienia trypsyną zapewnia wiarygodne wyniki analizy spektrometrii masowej w czasie krótszym niż 2 godziny.
- Zobacz wszystkie (25)
Powiązane protokoły
- Dr. Alan Robertson and Dr. Ben Davis at Vernalis, Ltd., UK, a provider of drug discovery and development services, have refined a novel protocol for the duallabelling of proteins using EnPresso® B Defined Nitrogen-free.
- SigmaMab Antibody Drug Conjugate Mimic, is a non-toxic drug mimic utilized as a standard for mass spectrometry and high performance liquid chromatography.
- solution, 2 μg/mL in acetonitrile, analytical standard
- The development of modern mass spectrometry (MS) equipment with high resolution and mass accuracy has led to its use in analyzing glycans for both profiling and structural studies.
- Biomarkers play an essential role in the drug discovery and development process.
- Zobacz wszystkie (12)
Znajdź więcej artykułów i protokołów
Jak możemy pomóc
W przypadku jakichkolwiek pytań, prosimy o przesłanie prośby o wsparcie klienta
lub rozmowę z naszym zespołem obsługi klienta:
Email custserv@sial.com
lub zadzwoń +1 (800) 244-1173
Dodatkowe wsparcie
- Chromatogram Search
Use the Chromatogram Search to identify unknown compounds in your sample.
- Kalkulatory i aplikacje
Web Toolbox - narzędzia naukowe i zasoby dla chemii analitycznej, nauk przyrodniczych, syntezy chemicznej i materiałoznawstwa.
- Customer Support Request
Obsługa klienta, w tym pomoc przy zamówieniach, produktach, kontach i kwestiach technicznych związanych z witryną.
- FAQ
Explore our Frequently Asked Questions for answers to commonly asked questions about our products and services.
Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.
Nie masz konta użytkownika?