Koniugaty Ni-NTA-Atto

Koniugaty Ni-NTA-Atto do czułego, specyficznego wykrywania białek znakowanych polihistydyną

Nowoczesne aplikacje rekombinowanych białek wymagają niezawodnych metod wykrywania. Polihistydyna jest jednym z najpopularniejszych znaczników powinowactwa dodawanych do rekombinowanych białek. Może być wstawiana na N- lub C-końcu i wyrażana w różnych gospodarzach. Ze względu na swój niewielki rozmiar, znacznik polihistydynowy służy jako eleganckie narzędzie zarówno do oczyszczania, jak i wykrywania białek. Immunodetekcja białek fuzyjnych znakowanych His na Western blot zazwyczaj wykorzystuje przeciwciało przeciwko polihistydynie, a następnie przeciwciało drugorzędowe sprzężone z enzymem, takim jak peroksydaza chrzanowa lub fosfataza alkaliczna. Białko jest następnie wykrywane za pomocą odpowiedniego substratu enzymatycznego.

Koniugaty Ni-NTA-Atto zapewniają specyficzne i wysoce czułe wykrywanie białek fuzyjnych znakowanych His. Kompleks Ni-NTA-Atto (Nα,Nα-bis(karboksymetylo)-L-lizyna, kompleks niklu(II), sprzężony z barwnikiem Atto) jest specyficzny dla znaczników polihistydynowych przy minimalnej reaktywności krzyżowej. Barwniki Atto dostarczają silnych sygnałów fluorescencyjnych przy powszechnie dostępnych długościach fal i przy niewielkim wygaszaniu. Koniugaty Ni-NTA-Atto mogą być bezpośrednio nakładane na żel SDS-PAGE lub membranę Western blot w celu obrazowania fluorescencyjnego i były z powodzeniem stosowane w żywych komórkach.^1,2 Wykrywanie za pomocą koniugatów Ni-NTA-Atto wymaga krótszego czasu inkubacji niż w przypadku wiązania białko-przeciwciało. Nie jest wymagana reakcja wtórna, ponieważ kompleks Ni-NTA jest bezpośrednio sprzężony z fluoroforem. Skutkuje to szybszą i bardziej elastyczną procedurą niż tradycyjna metoda immunodetekcji (Rysunek 1).

Rysunek 1. Porównanie wykrywania białek za pomocą tradycyjnej chemiluminescencyjnej immunodetekcji przeciwciał (po lewej) z wykrywaniem za pomocą koniugatu Ni-NTA-Atto (po prawej). Immunodetekcja odbywa się na membranie transferowej po Western blotting, podczas gdy koniugaty Ni-NTA-Atto mogą być stosowane zarówno z membranami transferowymi, jak i bezpośrednio na żelach SDS-PAGE po utrwaleniu.

Bezpośrednia detekcja białek znakowanych histydyną na żelach SDS-PAGE

Bezpośrednie zastosowanie koniugatów Ni-NTA-Atto na żelach SDS-PAGE zapewnia szybką i łatwą detekcję w celu monitorowania oczyszczania białek lub ekspresji białek w różnych punktach czasowych. Granica wykrywalności 50 ng dla p38 MAPK znakowanego His została zaobserwowana przy użyciu obrazowania fluorescencyjnego (Rysunek 2).

Rysunek 2. Białko p38 MAPK znakowane His (500 ng - 25 ng) rozdzielono na 4-20% żelu Tris-Glycine SDS-PAGE. Żel utrwalono przez noc w 40% etanolu/10% kwasie octowym, przemyto wodą i inkubowano z Ni-NTA-Atto 647N (1:1000) w ciemności. Żel przemyto, a następnie zobrazowano za pomocą skanera laserowego FLA-3000 Fuji® ze wzbudzeniem 633 nm i filtrem emisji 675 nm. Ni-NTA-Atto 647N (λex 647 nm, λem 669 nm) jest wzbudzany w czerwonym obszarze widma.

Wykrywanie białek znakowanych histydyną po transferze Western Blot

Po elektroforezie białka mogą być przenoszone z żeli SDS-PAGE na membrany PVDF o niskiej fluorescencji, które są bardziej odporne na manipulacje. Tradycyjne Western bloty dobrze sprawdzają się w przypadku znaczników polihistydynowych, ale są czasochłonne. Koniugaty Ni-NTA-Atto łączą zalety wysoce specyficznego wykrywania z szybszą procedurą.

Aplikacja koniugatów Ni-NTA-Atto na membranę daje czułość porównywalną z bezpośrednim wykrywaniem żelu. Suszenie membrany zwiększa intensywność sygnału (Rysunek 3). Ponadto koniugaty Ni-NTA-Atto można usunąć z używanej membrany za pomocą 60-90-minutowej inkubacji w 20 mM EDTA.

Rysunek 3. Białko p38 MAPK znakowane His (500 ng - 25 ng) rozdzielono na 4-20% żelu SDS-PAGE. Białko przeniesiono na niskofluorescencyjną membranę PVDF, zablokowano na noc 5% BSA w PBS, przepłukano PBS-T i inkubowano z Ni-NTA-Atto 647N (1:1000) w ciemności. Membranę przepłukano, a następnie zobrazowano za pomocą skanera laserowego FLA-3000 Fuji ze wzbudzeniem 633 nm i filtrem emisji 675 nm.

Porównanie procedur dla tradycyjnego Western immunoblot i koniugatów Ni-NTA-Atto przedstawiono w Tabeli 1. Bezpośrednie wykrywanie w żelu SDS-PAGE jest najwygodniejsze, ponieważ pomija etap transferu. Podobne limity detekcji z koniugatami Ni-NTA-Atto obserwuje się dla błon Western blot w porównaniu z żelami SDS-PAGE, ale bez ryzyka uszkodzenia żelu. W obu przypadkach czas pracy jest krótszy niż w przypadku tradycyjnej techniki przeciwciał.

Tabela 1. Porównanie protokołów tradycyjnego Western immunoblot, Western blot z użyciem koniugatu Ni-NTA-Atto i bezpośredniego wykrywania na żelu SDS-PAGE z użyciem koniugatu Ni-NTA-Atto. Roztwór podstawowy Ni-NTA-Atto przygotowuje się przez rozpuszczenie 250 μg w 250 μl PBS.

Koniugaty Ni-NTA-Atto stanowią cenną alternatywę dla tradycyjnej immunodetekcji przeciwciał w celu specyficznego i czułego wykrywania białek fuzyjnych znakowanych His. Zastosowanie Ni-NTA-Atto skraca czas eksperymentu i eliminuje czasochłonne eksperymenty walidacji przeciwciał, oszczędzając zarówno czas, jak i koszty.

Referencje

1. 2006. Single Molecule Detection with Atto 647N NTA. BioFiles.(3):8-9.

2. Guignet EG, Hovius R, Vogel H. 2004. Reversible site-selective labeling of membrane proteins in live cells. Nat Biotechnol. 22(4):440-444. https://doi.org/10.1038/nbt954