Proteinaza K: Wprowadzenie i zastosowania

Co to jest proteinaza K?

Proteinaza K jest proteazą serynową, która rozkłada białka poprzez hydrolizę wiązań peptydowych. Jest to proteaza o szerokim spektrum działania, która może trawić szeroką gamę białek, w tym te, które są odporne na inne proteazy.

Proteinaza K jest powszechnie stosowana w biologii molekularnej i biochemii do trawienia białek strukturalnych i enzymów. Jest przydatna w usuwaniu nukleaz, które mogą degradować DNA i RNA, a także w izolacji nienaruszonego genomowego DNA z różnych źródeł. Proteinaza K jest również stosowana w analizie struktury i funkcji białek prionowych (Cronier et al. 2008).

Proteinaza K jest stabilna w szerokim zakresie pH, temperatury i może wytrzymać wiele detergentów i środków denaturujących. W rezultacie jest skuteczna w przygotowywaniu próbek w różnych zastosowaniach badawczych i diagnostycznych.

Do czego służy proteinaza K?

Proteinaza K jest powszechnie stosowana do izolacji DNA lub RNA w badaniach biologii molekularnej poprzez degradację niepożądanych białek w próbce, takich jak nukleazy, RNazy i DNazy. Proteinaza K jest również stosowana w procesie ekstrakcji kwasów nukleinowych w celu rozbicia białkowego składnika błony komórkowej i umożliwienia dostępu do DNA i RNA. Jest skuteczna w trawieniu wielu rodzajów białek, w tym tych, które są odporne na inne rodzaje proteaz, takie jak trypsyna.

Oprócz badań z zakresu biologii molekularnej, proteinaza K jest wykorzystywana w szerokim zakresie innych zastosowań, w tym w produkcji farmaceutycznej i zastosowaniach diagnostycznych. Może być stosowana w przemyśle farmaceutycznym do usuwania niepożądanych białek w procesie produkcyjnym.  W diagnostyce jest stosowana do izolacji DNA i RNA z próbek klinicznych do dalszej analizy.  

.

Dlaczego proteinaza K jest używana do ekstrakcji DNA i RNA?

Proteinaza K jest stosowana w ekstrakcji DNA i RNA, ponieważ jest enzymem proteolitycznym, który może rozkładać białka, w tym te obecne w błonie komórkowej i jądrze. W przypadku stosowania proteinazy K do ekstrakcji DNA i RNA, jest ona zwykle dodawana do buforu lizującego, który zawiera detergenty i sole, które pomagają rozerwać błonę komórkową i uwolnić kwasy nukleinowe do roztworu. Proteinaza K następnie trawi białka w lizowanej próbce, w tym histony i inne białka chromosomalne, które w przeciwnym razie mogą zakłócać dalsze zastosowania, takie jak PCR, RT-PCR, sekwencjonowanie Sangera, sekwencjonowanie następnej generacji (NGS), fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) oraz inne badania biologii molekularnej i zastosowania diagnostyczne. Zastosowanie proteinazy K w ekstrakcji DNA i RNA pomaga zapewnić czystość i integralność próbki.

Dlaczego proteinaza K jest używana w PCR?

Proteinaza K nie jest zwykle stosowana bezpośrednio w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), ale jest stosowana na etapie ekstrakcji DNA przed PCR w celu poprawy jakości próbki DNA. 

Proteinaza K jest skuteczna w rozkładaniu szerokiej gamy białek, w tym tych, które są odporne na inne rodzaje proteaz, takie jak trypsyna. Usuwając zanieczyszczenia białkowe z próbki DNA przed PCR, można poprawić wydajność i dokładność reakcji, co prowadzi do bardziej wiarygodnych wyników. Dodatkowo, zastosowanie proteinazy K w ekstrakcji DNA może pomóc zmniejszyć ryzyko wystąpienia wyników fałszywie ujemnych lub innych błędów w testach diagnostycznych, w których dokładne i wiarygodne wyniki mają kluczowe znaczenie.

Podczas PCR matryca DNA jest amplifikowana poprzez serię cykli denaturacji, annealingu i wydłużania. Wszelkie zanieczyszczenia w próbce DNA, takie jak białka, mogą zakłócać ten proces poprzez hamowanie aktywności enzymu polimerazy lub zakłócanie wiązania starterów z matrycą.

Jaki jest mechanizm działania proteinazy K?

Proteinaza K jest proteazą serynową, która rozszczepia wiązania peptydowe w białkach. Jej mechanizm działania obejmuje kilka etapów:

1.  Wiązanie: Proteinaza K najpierw wiąże się z białkiem lub substratem kwasu nukleinowego poprzez niespecyficzne interakcje hydrofobowe.
2. Aktywacja: Po związaniu enzym przechodzi etap aktywacji, w którym katalityczna reszta serynowa jest aktywowana przez resztę histydynową i cząsteczkę wody. Prowadzi to do utworzenia miejsca aktywnego, które może rozszczepiać wiązania peptydowe.
3. Rozszczepianie:
Miejsce aktywne proteinazy K rozszczepia wiązanie peptydowe po stronie kwasu karboksylowego reszt aminokwasowych, które zawierają aromatyczne, alifatyczne lub hydrofobowe reszty aminokwasowe. Enzym może również rozszczepiać wiązania peptydowe po stronie amidowej reszt glicyny.
4. Uwalnianie produktu: Po rozszczepieniu produkty reakcji (tj, peptydy) są uwalniane z enzymu.

Mechanizm działania proteinazy K jest podobny do innych proteaz serynowych, ale wyróżnia się zdolnością do działania w trudnych warunkach, takich jak wysokie temperatury i obecność detergentów.

Jaka jest różnica między proteazą a proteinazą K?

Proteazy i proteinaza K to proteazy, które różnią się pod pewnymi istotnymi względami. Proteazy to klasa enzymów, które rozszczepiają wiązania peptydowe w białkach. Istnieje wiele różnych rodzajów proteaz, w tym między innymi proteazy serynowe, proteazy cysteinowe i metaloproteazy. Enzymy te biorą udział w wielu procesach biologicznych, w tym w degradacji białek, krzepnięciu krwi i trawieniu. Alternatywnie, proteinaza K jest specyficznym rodzajem proteazy serynowej, która jest szeroko stosowana do trawienia białek i odsłaniania kwasów nukleinowych, które zostały wyizolowane z komórek lub tkanek.

Na czym polega metoda ekstrakcji DNA proteinazą K?

Metoda ekstrakcji DNA proteinazą K jest powszechnie stosowana do izolacji wysokiej jakości DNA do dalszych zastosowań, takich jak PCR, sekwencjonowanie i klonowanie. Metoda ta jest szczególnie przydatna w przypadku próbek zawierających duże ilości białek, takich jak tkanki lub komórki, ponieważ pozwala na skuteczne usuwanie białek bez uszkadzania DNA. Metoda ekstrakcji DNA proteinazą K zazwyczaj obejmuje następujące etapy:

1. Liza próbki:Liza komórek lub tkanek i uwolnienie genomowego DNA poprzez dodanie buforu lizującego do próbki, który zawiera detergenty i inne odczynniki, które zakłócają błonę komórkową i rozbijają kompleksy białkowe.
2. Trawienie białek: Dodanie proteinazy K do próbki w celu strawienia białek związanych z DNA. Enzym jest zwykle dodawany do próbki w końcowym stężeniu 0,2-1 mg/ml i inkubowany w optymalnej temperaturze (55-65 °C) przez 30-60 minut.
3. Dezaktywacja: Po zakończeniu trawienia białka, proteinaza K jest dezaktywowana przez podgrzanie próbki do temperatury powyżej
   95 °C przez kilka minut lub przez dodanie inhibitora proteazy do próbki.
4. Izolacja DNA: DNA można następnie wyizolować z próbki różnymi metodami, takimi jak wytrącanie etanolem lub izopropanolem, lub przy użyciu komercyjnego zestawu do izolacji DNA

.

Jaka jest rola proteinazy K w testach na obecność COVID-19?

Proteinaza K nie testuje bezpośrednio wirusa SARS-CoV-2, ale jest używana na etapie ekstrakcji RNA w procesie diagnostycznym COVID-19.

Wirus zawiera materiał genetyczny w postaci RNA. Aby wykryć obecność wirusa, test obejmuje najpierw ekstrakcję RNA z próbki pacjenta, takiej jak wymaz z nosa, a następnie zastosowanie RT-PCR (reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją) w celu amplifikacji i wykrycia określonych sekwencji wirusowego RNA. Proteinaza K może być stosowana w procesie ekstrakcji RNA do trawienia i inaktywacji RNaz, chroniąc w ten sposób RNA, eliminując fałszywie ujemne wyniki i poprawiając dokładność testu diagnostycznego COVID-19.

Zamówienia hurtowe na proteinazę K

Możliwości masowe i niestandardowe rozmiary opakowań proteinazy K są dostępne dla konkretnych zastosowań. Wypełnij formularz, aby uzyskać więcej informacji na temat naszej oferty. 

LEARN MORE

Referencje

1. Cronier S, Gros N, Tattum M, Jackson G, Clarke A, Collinge J, Wadsworth J. 2008. Detection and characterization of proteinase K-sensitive disease-related prion protein with thermolysin. 416(2):297-305. https://doi.org/10.1042/bj20081235

2. Ñique AM, Coronado-Marquina F, Mendez Rico JA, García Mendoza MP, Rojas-Serrano N, Simas PVM, Cabezas Sanchez C, Drexler JF. A faster and less costly alternative for RNA extraction of SARS-CoV-2 using proteinase k treatment followed by thermal shock. PLoS ONE. 16(3):e0248885. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0248885

3. Sinha MK, Songer T, Xiao Q, Sloan JH, Wang J, Ji S, Alborn WE, Davis RA, Swarbrick MM, Stanhope KL, et al. 2007. Analytical Validation and Biological Evaluation of a High–Molecular-Weight Adiponectin ELISA. 53(12):2144-2151. https://doi.org/10.1373/clinchem.2007.090670

4. Marzinotto S, Mio C, Cifù A, Verardo R, Pipan C, Schneider C, Curcio F. A streamlined approach to rapidly detect SARS-CoV-2 infection, avoiding RNA purification. https://doi.org/10.1101/2020.04.06.20054114

5. Samal BB, Karan B, Parker C, Stabinsky Y. 1991. Isolation and thermal stability studies of two novel serine proteinases from the fungus Tritirachium album Limber. Enzyme and Microbial Technology. 13(1):66-70. https://doi.org/10.1016/0141-0229(91)90190-l

6. KRAUS E, FEMFERT U. 1976. Proteinase K from the MoldTritirachium albumLimber. Specificity and Mode of Action. Hoppe-Seyler´s Zeitschrift für physiologische Chemie. 357(2):937-948. https://doi.org/10.1515/bchm2.1976.357.2.937