Technologia wysokiej czystości i zestawy do adsorpcji krzemionki

Zestawy do adsorpcji High Pure i krzemionki opracowane przez firmę Roche zależą od tendencji kwasów nukleinowych do adsorpcji na krzemionce (szkle) w obecności soli chaotropowej, takiej jak jodek sodu (NaI), tiocyjanian guanidyny lub chlorowodorek guanidyny [Melzak et al. (1996), J. Colloid Interface Sci. (USA) 181, 635-644]. Tendencja ta została odkryta przez Vogelsteina i Gillespie [Vogelstein, B. i Gillespie, D. (1979), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 615-619], którzy odkryli, że fragmenty DNA adsorbują się na sproszkowanym szkle krzemiennym w obecności nasyconego NaI. Późniejsze prace wykazały, że inne kwasy nukleinowe adsorbują się na szkle w obecności innych chaotropów.

Różne rodzaje kwasów nukleinowych adsorbują się mniej lub bardziej ściśle na szkle w zależności od siły jonowej i pH otaczającego roztworu. Do elucji kwasu nukleinowego ze szkła stosuje się bufor o niskiej zawartości soli lub wodę. W każdym zestawie metoda ta jest zoptymalizowana pod kątem przygotowania określonego rodzaju kwasu nukleinowego. W każdym zestawie High Pure kroki są zasadniczo takie same i wymagają zaledwie kilku minut. Kwasy nukleinowe przygotowane za pomocą tych zestawów mogą być używane bezpośrednio w różnych dalszych zastosowaniach.

Rysunek 1. Zasada działania kolumny obrotowej

Zestawy High Pure

Zestawy High Pure (np. High Pure PCR Template Preparation Kit, Product No. 11796828001; High Pure PCR Cleanup Micro Kit, Product No. 4983955001) wykorzystują włókninę szklaną unieruchomioną w specjalnej plastikowej probówce z filtrem.

Zestaw do adsorpcji krzemionki

Zamiast włókna szklanego (jak w zestawach High Pure), zestaw do ekstrakcji DNA w żelu agarozowym (nr produktu. 11696505001) wykorzystuje kulki krzemionkowe, które są przenoszone przez pipetowanie, aby adsorbować DNA.

Zestaw wykorzystuje kroki podobne do tych z zestawów High Pure do oczyszczania DNA z materiału wyjściowego. Kwas nukleinowy jest adsorbowany na krzemionce w obecności soli chaotropowej, granulowany przez odwirowanie (podczas adsorpcji na kulkach krzemionkowych), intensywnie płukany w celu usunięcia zanieczyszczeń, a następnie uwalniany z kulek za pomocą buforu o niskiej zawartości soli. Wyizolowane DNA jest wystarczająco czyste, aby można je było wykorzystać bezpośrednio do znakowania, sekwencjonowania, ligacji i transformacji oraz innych procedur wymagających stężonego DNA.