Dalsze zastosowania po oczyszczeniu genomowego DNA
Następująca tabela podsumowuje ogólne rozważania dotyczące ilości i czystości dla kilku typowych zastosowań genomowego DNA.
Trawienie enzymami restrykcyjnymi
Trawienie genomowego DNA enzymami restrykcyjnymi jest często wykonywane w celu przygotowania DNA do późniejszej manipulacji. W trawieniu enzymami restrykcyjnymi zwykle stosuje się od 0,5 do 10 μg DNA. Genomowe DNA może być trawione rzadkim enzymem tnącym (np, NotI) w celu wygenerowania dużych fragmentów, za pomocą zwykłego kutra w celu wygenerowania małych fragmentów lub za pomocą określonych kombinacji enzymów restrykcyjnych.
Sole, rozpuszczalniki organiczne i RNA mogą zakłócać trawienie enzymami restrykcyjnymi lub analizę strawionych fragmentów.
Klonowanie
Klasyczna technika klonowania fragmentów genomowego DNA do plazmidu lub innego wektora obejmuje trawienie jednym lub kilkoma enzymami restrykcyjnymi, a następnie enzymatyczną ligację fragmentów do linearyzowanego wektora. Trawienie rzadkimi enzymami tnącymi (np. NotI) wytwarza duże fragmenty do klonowania do YAC i BAC. Trawienie za pomocą częstych kutrów wytwarza mniejsze fragmenty, które mogą być klonowane do plazmidów. Gdy celem jest przygotowanie losowych fragmentów DNA, jest to określane jako klonowanie "shotgun". Aby przyjrzeć się powtórzeniom i ekspansjom w genomowym DNA, konieczne może być wygenerowanie dużych bibliotek wstawek w celu wydajnego złożenia sekwencji. Zastosowanie krzemionki i mediów anionowymiennych do przygotowania genomowego DNA zazwyczaj nie daje fragmentów o wielkości 50 kb. Dlatego należy dokładnie rozważyć zaprojektowanie procedur, które mogą obejmować izolację strawionego genomowego DNA z zatyczek żelowych i frakcjonowanie wielkości przy użyciu systemów PFGE lub jednorodnego pola elektrycznego z zaciskiem Contour (CHEF). Klonowanie można również przeprowadzić przy użyciu technik opartych na PCR. Zwykle wykorzystują one PCR do amplifikacji fragmentów genomowego DNA przed ligacją do wektorów biorców, w których można wprowadzić określone mutacje punktowe w celu zmiany funkcji.
Sklonowane produkty są zwykle wykorzystywane do sekwencjonowania, mapowania hybrydyzacji, mutagenezy ukierunkowanej na miejsce oraz kontroli transkrypcji i translacji ekspresji genów. Inne zastosowania to nadekspresja określonych białek (ze znacznikami lub bez), a także eksperymenty transfekcji w celu zbadania struktury i funkcji znanych białek.
Sekwencjonowanie
Po klonowaniu i propagacji klonów w odpowiednim gospodarzu, DNA może być sekwencjonowane. Ogólnie rzecz biorąc, reakcje sekwencjonowania są bardzo solidne i rzadko nie generują przynajmniej części danych. Chociaż istnieje szereg kwestii związanych ze składem sekwencji DNA, które mogą wpływać na wywoływanie zasad, całkowite niepowodzenie reakcji jest rzadkie.
Jakość DNA może mieć wpływ na ogólną wydajność. Często samo przeciążenie reakcji sekwencjonowania cyklicznego szablonem DNA może mieć negatywny wpływ. Dlatego zalecamy dokładne określenie stężenia i masy DNA przed sekwencjonowaniem.
Zwykle, jeśli wyniki sekwencjonowania są słabe, ale amplifikacja genomowego DNA zakończyła się powodzeniem, jak oceniono na podstawie wizualizacji żelu, konsensus jest taki, że zanieczyszczenie i inhibicja genomowego DNA nie przyczyniają się do słabych wyników; słabe wyniki można przypisać starterom lub innym odczynnikom stosowanym w reakcjach sekwencjonowania.
Typowe wyniki sekwencjonowania przy użyciu zestawu illustra triplePrep, który może izolować genomowe DNA, całkowity RNA i całkowite zdenaturowane białko z pojedynczej niepodzielonej próbki, lub zestawu DNeasy™ przedstawiono na Rysunku 4.2. Wysoki wynik Phred 20 wskazuje na wysoką jakość genomowego DNA do zastosowań takich jak PCR i sekwencjonowanie.
Aplifikacja PCR
PCR jest bardzo wydajną techniką, którą można wykorzystać do przygotowania fragmentów genomowego DNA do późniejszych zastosowań, w tym sekwencjonowania, klonowania i genotypowania. Jeśli późniejsza analiza ma być zautomatyzowana, podczas PCR zwykle stosuje się barwniki fluorescencyjne. Typowe ilości ludzkiego genomowego DNA stosowane w reakcjach PCR wynoszą od 5 do 50 ng. Interesujące dla onkologów jest monitorowanie tkanek i komórek pod kątem genów związanych z rakiem, które mogły zostać wzmocnione lub usunięte podczas rozwoju guza. Opracowano metody, które umożliwiają bezstronną identyfikację zmian w kopiach genomowych poprzez zrównoważony proces PCR, który uwzględnia nasycenie PCR i różnice zanieczyszczeń w próbkach podczas porównywania komórek chorych z normalnymi (8). Procedura pojedynczej probówki zastosowana przez Wang et al. umożliwia zastosowanie zrównoważonej reakcji PCR do genomowego DNA uzyskanego z małej liczby komórek, co ma znaczenie dla macierzy-CGH i kwantyfikacji PCR w czasie rzeczywistym. Ta sama procedura może być stosowana do umiarkowanie zdegradowanego DNA uzyskanego z tkanki zatopionej w parafinie. Chociaż tylko niewielkie ilości genomowego DNA są niezbędne do reakcji amplifikacji PCR, zanieczyszczenia mogą hamować reakcje PCR. Zanieczyszczenia te obejmują hemoglobinę lub heparynę w próbkach genomowego DNA z krwi, a także śladowe detergenty wprowadzone podczas przygotowywania próbek. Niska jakość DNA może prowadzić do słabych wyników w PCR.
Aby zminimalizować degradację DNA przez endogenne nukleazy, próbki powinny być prawidłowo pobierane i przechowywane.
W eksperymencie pokazanym na Rysunku 4.3, amplikony 11 kb zostały pomyślnie amplifikowane i nie zaobserwowano żadnych efektów hamujących w przypadku genomowego DNA oczyszczonego przy użyciu genomicPrep lub QIAamp™. Wyniki pokazują, że duży rozmiar genomowego DNA wyizolowanego przy użyciu zestawu illustra bacteria genomicPrep Mini Spin Kit sprawia, że nadaje się on do długich reakcji PCR.
Rysunek 4.3. Amplifikacja amplikonu 11 kb z oczyszczonego bakteryjnego genomowego DNA. Do każdej reakcji użyto pięciu mikrolitrów roztworu eluowanego genomowego DNA, co odpowiada 50-150 ng genomowego DNA. Po PCR, równe objętości z każdej reakcji zostały rozdzielone na 0,8% żelu agarozowym zabarwionym bromkiem etydyny. M = marker o masie cząsteczkowej 1 kb
W innym eksperymencie, kilka próbek genomowego DNA wyizolowanego z ludzkiej krwi pełnej za pomocą Genomic-tip 100/G lub illustra blood genomicPrep Midi Flow Kit oceniono w eksperymentach PCR w czasie rzeczywistym (Rysunek 4.4). Wszystkie próbki wykazywały bardzo podobne krzywe amplifikacji, wykazując powtarzalną jakość wyizolowanego genomowego DNA i jego kompatybilność z zastosowaniami PCR w czasie rzeczywistym.
Rysunek 4.4Amplifikacja PCR w czasie rzeczywistym z genomowego DNA wyekstrahowanego z 5 ml ludzkiej krwi pełnej przy użyciu zestawu illustra genomicPrep Blood Midi Flow Kit i końcówki Genomic-tip 100/G firmy Qiagen. Genomowe DNA zostało wyizolowane zgodnie z instrukcjami producenta. Jako matrycę wykorzystano sto ng genomowego DNA. Użyto starterów do przodu i do tyłu chromosomu 2.
Genotypowanie
Termin genotypowanie odnosi się do zestawów testów, które ujawniają tożsamość genetyczną i sposób dziedziczenia niektórych cech od rodziców. Zmiany w genomowym DNA mogą korelować z utraconą lub zmniejszoną funkcją białka, prowadząc do mierzalnej zmiany w biomarkerze komórkowym lub fenotypie. Potężne testy genotypowania mogą być wykorzystywane w identyfikacji kryminalistycznej, mapowaniu genów chorób, farmakogenomice, ewolucji i badaniu dynamiki populacji. Zmienność genetyczna może występować jako zmiany pojedynczych zasad, delecje, insercje, powtarzające się elementy, rearanżacje i inne modyfikacje sekwencji, takie jak metylacja.
Genotypowanie ewoluowało od najprostszych testów, w których odciski palców DNA były przeprowadzane na żelach w celu zbadania RFLP, do bardziej współczesnych podejść, które wykorzystują wysoce zrównoleglone metody i zautomatyzowane systemy wykrywania. Podczas gdy zestawy sond można opracować w celu ujawnienia zmiany pojedynczej zasady w pojedynczym genie, badacze często są zainteresowani ujawnieniem wielu zmian SNP w jednym genomie. Zmienność pojedynczych nukleotydów została scharakteryzowana dla wielu genów i loci w ludzkim genomie, co stanowi ponad 1,5 miliona SNP. Międzynarodowy Projekt HapMap tworzy bardziej szczegółowy, globalny obraz SNP i ich grupowania w haplotypy. Wraz z rozwojem metod możliwe stało się przeprowadzenie badań asocjacyjnych obejmujących cały genom w celu ujawnienia poszczególnych SNP i haplotypów, które są skorelowane z podatnością na choroby. Ostatecznie, mutacje mogą być sprawdzane pod kątem autentyczności poprzez resekwencjonowanie regionów próbek genomowego DNA.
Przygotowanie próbek genomowego DNA jest kluczem do osiągnięcia optymalnych wyników w różnych analizach genotypowania. Poszczególne testy genotypowania oparte na sondach amplikonowych mogą zużywać od 10 do 50 ng genomowego DNA i wymagają zestawów starterów i sond specyficznych dla sekwencji. Dostępne są chipy do aCGH i SNP, które obejmują setki tysięcy wariantów allelicznych. Każdy chip kosztuje około 1000 USD i może raportować globalne zmiany w liczbie kopii DNA i zmienności specyficznej dla sekwencji, ale zużywa nie więcej niż 0,5 do 1 μg genomowego DNA. Gdy dostępne są bardzo ograniczone ilości DNA, możliwe jest użycie WGA w celu zapewnienia wystarczającego materiału wyjściowego.
Czynniki jakościowe, które mogą wpływać na możliwość wykorzystania genomowego DNA do genotypowania, obejmują stan degradacji próbek, poziom czystości i to, czy próbki są zanieczyszczone egzogennym DNA.
Ograniczenie zanieczyszczenia krzyżowego amplifikowanych próbek jest bardzo ważne, aby uniknąć błędnej interpretacji i tworzenia fałszywie dodatnich wyników. Opublikowano wiele artykułów opisujących taktykę izolacji i przepływ pracy w celu zminimalizowania zanieczyszczenia krzyżowego (9).
Poniżej przedstawiono przykład wyników genotypowania. Próbki krwi od 10 osób zostały pobrane na matrycę Whatman FTA Elute i przetworzone do analizy genotypowania genu UGT2B15*2. Próbki przeprowadzono w zestawach czterech powtórzeń i wykreślono jako funkcję fluorescencji dwóch barwników HEX i FAM. Rysunek 4.5 pokazuje wyraźne rozróżnienie między próbkami heterozygotycznymi (wt/mut) i homozygotycznymi (mut/mut lub wt/wt). Tego typu dane pokazują, że FTA Elute daje bardzo czystą matrycę DNA, która jest powtarzalna i doskonała do stosowania z wysoce czułą technologią Scorpions ARMS.
Rysunek 4.5. Genotypowanie przeprowadzono na czterech powtórzeniach po 10 różnych próbek DNA oczyszczonych na FTA Elute. Test został przeprowadzony na urządzeniu do PCR w czasie rzeczywistym Stratagene Mx3000P™. Testy Scorpions ARMS wykorzystują specyficzność ARMS w połączeniu z sygnalizacją sond Scorpions do generowania danych. Odczyty fluorescencji wykonano przed i po PCR. NTC oznacza brak kontroli szablonu.
Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.
Nie masz konta użytkownika?