Identyfikacja mikroorganizmów na podstawie koloru
Kolor jest ważny w naszym życiu jako narzędzie do różnicowania.
Testy biochemiczne powszechnie wykorzystują system kolorów.
Dla mikrobiologów najbardziej podstawowa barwa została opracowana w 1884 roku przez duńskiego bakteriologa Hansa Christiana Grama. Barwnik Grama umożliwia określenie morfologii, dzieląc bakterie na dwie duże grupy. Bakterie zabarwione na fioletowo nazywane są "Gram-dodatnimi". Bakterie zabarwione na różowo nazywane są "Gram-ujemnymi". Ta technika barwienia dostarcza informacji o strukturze ściany komórkowej, ponieważ organizmy Gram-dodatnie mają tylko siatkę peptydoglikanu, a komórki Gram-ujemne posiadają dodatkową dwuwarstwę lipidową. Ta informacja jest ważnym predyktorem reakcji na antybiotyki, ponieważ wiele z nich jest skutecznych tylko w przypadku bakterii Gram-dodatnich. Barwienie metodą Grama pozostaje ważne dla identyfikacji bakterii i stanowi podstawę wyboru testów biochemicznych. (Tabela 1 i Rysunek 1).
Rysunek 1. Barwienie metodą Grama (po lewej Gram-dodatni Bacilus cereus, po prawej Gram-ujemny Citrobacter).
Często wymagana jest szybka, prosta i tania metoda potwierdzania lub oznaczania bakterii w wodzie lub żywności. Jedna z takich metod wykorzystuje chromogenne i fluorescencyjne podłoże w połączeniu z selektywnymi pożywkami. Inną metodą jest użycie odczynników do testów biochemicznych. Wszystkie testy biochemiczne opierają się na selektywnym wykrywaniu charakterystycznej aktywności enzymatycznej dla różnych mikroorganizmów. Celem jest rozróżnienie patogenów, wskazanie konkretnych problemów i pożądanego organizmu obecnego na określonym poziomie. W większości przypadków schemat identyfikacji (Rysunek 2) może pomóc zademonstrować prosty sposób. W ramach takich schematów identyfikacyjnych istnieją oczywiście inne testy, które nie wykorzystują systemów barwnych, takie jak test katalazy (wytwarzanie pęcherzyków powietrza), test wzrostu lub hamowania, testy mikroskopowe itp.
Jednym z najbardziej znanych i najczęściej stosowanych testów jest test indolowy (odczynniki Kovaca), w którym wykorzystywany jest mechanizm kompleksu barwnego. Zdolność mikroorganizmów do rozszczepiania indolu (benzopirolu) z cząsteczki tryptofanu przez tryptofanazy jest wykorzystywana do różnicowania Enterobacteriaceae. Tryptofanaza rozszczepia tryptofan do indolu, pirogronianu i NH3. p-Aminobenzaldehyd obecny w odczynniku wiąże się z indolem, tworząc wiśniowo-czerwony kompleks, rozpuszczalny w alkoholu, eterze i chloroformie.
Rysunek 2. Barwienie metodą Grama (po lewej Gram-dodatni Bacilus cereus, po prawej Gram-ujemny Citrobacter).
Rysunek 3. Barwienie metodą Grama (po lewej Gram-dodatni Bacilus cereus, po prawej Gram-ujemny Citrobacter).
Ponieważ alkohol izoamylowy lub butanol znajduje się w odczynniku, daje on górną fazę, która będzie wiśniowo-czerwona w reakcji pozytywnej. Zaleca się stosowanie pożywki wzrostowej bez glukozy i peptonu o wysokiej zawartości tryptofanu. Odczynnik Kovaca dodaje się do 24-48-godzinnej hodowli, np. inkubowanej w wodzie tryptonowej (70194). Czas inkubacji można skrócić do 4 godzin poprzez zaszczepienie większej ilości materiału komórkowego w mniejszej objętości. Lekkie wstrząsanie pomaga w ekstrakcji i w ciągu mniej niż minuty powinno pojawić się wiśniowo-czerwone zabarwienie wskazujące na pozytywną reakcję. Reakcja negatywna nie wykazuje zmiany koloru.
Inną często stosowaną metodą jest oznaczanie reakcji enzymatycznej wykrywanej za pomocą wskaźnika. Najczęściej stosowanymi wskaźnikami są wskaźniki pH, ale są też inne, takie jak redoks. Najprostszym systemem jest wykrywanie fermentacji z określonego cukru, takiego jak dekstroza, laktoza lub inne węglowodany. System ten można znaleźć w wielu pożywkach, takich jak Glucose Azide Broth z purpurą bromokrezolową jako wskaźnikiem (Rysunek 4) i Phenol Red Broth, który opiera się na wykrywaniu kwasu wytwarzanego w procesie fermentacji za pomocą wskaźnika pH, który zmienia kolor.
Rysunek 4. Barwienie metodą Grama (po lewej Gram-dodatni Bacilus cereus, po prawej Gram-ujemny Citrobacter).
Istnieją inne systemy oparte na produkcji siarkowodoru, takie jak cytrynian amonu i żelaza (pożywki) lub octan ołowiu (paski testowe). Interesującym systemem jest zestaw testowy ß-laktamazy, który jest szybkim testem kwasymetrycznym do wykrywania aktywności ß-laktamazy mikroorganizmów. Opiera się on na hydrolizie pierścienia ß-laktamowego w benzylopenicylinie, co skutkuje wytworzeniem kwasu penicylowego. Proces ten powoduje zakwaszenie zawiesiny bakteryjnej i zmianę koloru wskaźnika opartego na kwasie. W obecności mikroorganizmów z ß-laktamazą roztwór zmienia kolor z czerwonego na żółty. Wynik reakcji odczytuje się po 10-30 minutach (Rys. 5).
Istnieje wiele produktów, w których reakcje barwne są wykorzystywane do różnicowania i identyfikacji, a Sigma-Aldrich wymienia wszystkie te produkty w następujących grupach produktów:
Testy identyfikacyjne & Odczynniki
i. Odczynniki biochemiczne
ii. Krążki i paski biochemiczne
iii. Zestawy testowe
Media
i. Podłoża do identyfikacji biochemicznej
ii. Podłoża chromogenne
iii. Podłoża fluorogeniczne
Rysunek 5. Zestaw testowy ß-laktamazy (pozytywna reakcja jest wskazywana przez zmianę koloru na żółty)
Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.
Nie masz konta użytkownika?