Test angiogenezy tworzenia rurek z komórek śródbłonka

Co to jest angiogeneza?

Powstawanie nowych naczyń krwionośnych w organizmie jest generowane przez trzy procesy: waskulogenezę, arteriogenezę i angiogenezę.

• Waskulogeneza występuje tylko na wczesnym etapie rozwoju, dając początek prymitywnemu układowi krążenia, podczas gdy angiogeneza i arteriogeneza (również) mają miejsce w wieku dorosłym.
• Arteriogeneza obejmuje przebudowę i dojrzewanie istniejących naczyń w celu uzyskania w pełni rozwiniętych, funkcjonalnych tętnic, zwykle gdy większe tętnice są zatkane.
• Angiogeneza to fizjologiczne tworzenie nowych naczyń krwionośnych z istniejących, proces, który jest niezbędny dla rozwoju embrionalnego i płodowego oraz wzrostu narządów, wspomaga gojenie się ran i wzrost szkieletu, a także jest integralną częścią ciąży i kobiecego cyklu rozrodczego.^{1, 2} Jest on wywoływany przez niedotlenienie tkanek lub niewystarczające napięcie tlenu.³ Nowo utworzone naczynia krwionośne wyłożone komórkami śródbłonka dostarczają tlen i składniki odżywcze do tkanek, promują nadzór immunologiczny przez komórki krwiotwórcze i usuwają produkty przemiany materii.²

Angiogeneza jest ściśle regulowanym procesem, który jest równoważony przez sygnały pro- i antyangiogenne, w tym integryny, chemokiny, angiopoetyny, czynniki wyczuwające tlen, cząsteczki łączące i endogenne inhibitory.⁴ Jest cechą charakterystyczną ponad 50 różnych stanów chorobowych, a jego dysfunkcja jest związana między innymi z rakiem, łuszczycą, różnymi chorobami oczu, reumatoidalnym zapaleniem stawów, astmą i innymi chorobami autoimmunologicznymi, chorobami zakaźnymi, chorobami wieńcowymi, udarem mózgu, miażdżycą i upośledzonym gojeniem się ran.^{1, 5}

Rysunek 1. Mechanizmy angiogenezy (A) Bodźce angiogenne powodują powstanie gradientu cytokin i aktywują komórki śródbłonka. (B) Komórki śródbłonka rozbijają błonę podstawną, kiełkują w kierunku zewnętrznego gradientu i zaczynają migrować w kierunku bodźca angiogennego. Perycyty odłączają się od naczynia krwionośnego. (C) Ponowne połączenie komórek śródbłonka i utworzenie nowych kontaktów komórka-komórka oraz światła naczynia. (D) Stabilizacja naczyń krwionośnych poprzez rekrutację perycytów i rozpoczęcie przepływu krwi.

Assays to Study Angiogenesis

Kultura komórkowa tube formation assay po raz pierwszy opisany w 1988 roku przez Kubota i wsp.⁷ jest jednym z najczęściej stosowanych in vitro testów angiogenezy. Test polega na umieszczeniu komórek śródbłonka na podłożu podobnym do błony podstawnej, na którym komórki tworzą kanaliki w ciągu sześciu do 20 godzin. Kanaliki te zawierają głównie światło, a komórki rozwijają ścisłe kontakty komórka-komórka i macierz komórkowa. Kwantyfikację można przeprowadzić poprzez pomiar powierzchni kanalików lub długości i/lub liczby punktów rozgałęzień, przy czym pomiar powierzchni jest najczęstszą i najłatwiejszą metodą.^{6; 10} Ten potężny półilościowy test ma wiele zalet. Jest szybki i łatwy do przeprowadzenia, może być skalowany do analizy o wysokiej przepustowości, a czynniki mogą być dodawane egzogennie do pożywki, transfekowane do komórek lub eliminowane.⁹

Rola błony podstawnej w angiogenezie

 błona podstawna jest ważną macierzą zewnątrzkomórkową występującą we wszystkich tkankach śródbłonka. Utrzymuje integralność tkanek, służy jako bariera między komórkami i białkami, oddziela różne typy tkanek, przenosi sygnały mechaniczne, ma wiele funkcji biologicznych, które pomagają utrzymać specyficzność tkanek i działa jako magazyn czynników wzrostu i enzymów. Jego głównymi składnikami są lamininy, kolagen IV, proteoglikany siarczanu heparanu, różne czynniki wzrostu, cytokiny, chemokiny i proteazy. Do testu tworzenia rurek można przygotować błonę podstawną z tkanek lub guzów, ¹¹ lub można użyć warstwy matrycy żelowej fibryny, kolagenu lub żelu Matrigel/ECM. Rodzaj zastosowanej matrycy jest ważny, ponieważ różne matryce powodują różne tempo różnicowania. Wydaje się, że mechanizmy, za pomocą których komórki śródbłonka różnicują się, tworząc rurki, są przynajmniej częściowo zależne od matrycy, na której komórki są umieszczane; dlatego zaleca się testowanie substancji na więcej niż jednym typie matrycy.⁶

Wybór odpowiedniego typu komórek śródbłonka

Kluczowym aspektem dla zapewnienia udanych eksperymentów jest właściwy wybór komórek śródbłonka. Zdolność do tworzenia rurek różni się w zależności od różnych grup komórek śródbłonka, co sprawia, że istotne jest, aby wybrać warunki testu i typy komórek, które najbardziej przypominają warunki angiogenne lub badaną chorobę. U dorosłych ludzi występuje wysoki stopień heterogeniczności komórek śródbłonka wzdłuż drzewa naczyniowego. Ułatwia to biologiczną adaptację do lokalnych wymagań. Funkcjonalna heterogeniczność komórek śródbłonka jest zaangażowana w kontrolowanie zwężania i rozszerzania naczyń krwionośnych, krzepnięcia krwi, fibrynolizy, prezentacji antygenów, aterogenezy i katabolizmu lipoprotein. Istnieje również znaczna heterogeniczność komórek śródbłonka pochodzących z różnych miejsc w organizmie, związana z warunkami mikrośrodowiskowymi w każdym narządzie i wyspecjalizowanymi rolami, jakie odgrywa w nich śródbłonek.⁶

PromoCell dostarcza szeroką gamę komórek śródbłonka ze skóry, serca, płuc, macicy i tkanki odpiszczelowej, a także z dużych naczyń i pępowiny. Teoretycznie wszystkie te komórki śródbłonka powinny być zdolne do tworzenia rurek w odpowiednich warunkach. Jednak zakres tworzenia rurek i ich odpowiedzi na stymulatory i inhibitory angiogenezy różnią się znacznie w zależności od typu komórek. Test tworzenia rurek przedstawiony w poniższej sekcji został przetestowany w szczególności dla HUVEC, HDMEC, HCAEC, HPMEC, HAoEC i HCMEC.

Protokół testu tworzenia rurek komórek śródbłonka

1. Nasiej komórki śródbłonka i pozwól im rosnąć. Umieść komórki śródbłonka w odpowiednim naczyniu hodowlanym przy użyciu zalecanej pożywki PromoCell. Stosować gęstość wysiewu od 5X10³ komórek/cm² do 2X10⁴ komórek/cm² zgodnie z zaleceniami podanymi w instrukcji obsługi danego produktu. Wymieniaj podłoże hodowlane co 2-3 dni. Pozwól komórkom osiągnąć 70-90% konfluencji.
2. Odmroź ekstrakt z błony podstawnej i przygotuj 96-dołkową płytkę. Usuń ekstrakt z błony podstawnej-BME (taki jak Matrigel lub ECM Gel) z zamrażarki i umieść go w lodówce na lodzie. Proces rozmrażania zostanie zakończony po całonocnej inkubacji w temperaturze 4 °C. Oznacz dołki 96-dołkowej płytki zgodnie z podejściem eksperymentalnym i wstępnie schłódź ją w lodówce przez noc.
3. Dostosuj pożywkę i odczynniki do temperatury pokojowej.Umieść PBS (D8537), Accutase (A6964), zalecaną pożywkę podstawową dla komórek śródbłonka i zalecaną pożywkę wzrostową w temperaturze pokojowej na co najmniej 1 godzinę.
4. Pokryć 96-dołkową płytkę ekstraktem z błony podstawnej. Umieścić probówkę z całkowicie rozmrożonym BME na lodzie. Odwróć probówkę kilka razy. Załaduj 50-80 μL BME na studzienkę wstępnie schłodzonej płytki 96-dołkowej. BME powinien być równomiernie rozłożony w każdym dołku. Inkubować 96-dołkową płytkę w nawilżonym inkubatorze (37°C, 5% CO₂) przez 30 minut-1 godzinę. Podczas tego procesu inkubacji wykonaj kroki 5-8.
5. Przygotuj pożywki testowe. Rozpuść substancje testowe w zalecanej pożywce podstawowej. 1 ml każdej pożywki testowej jest potrzebny do ponownego zawieszenia 1X10⁵ - 1,5X10⁵ komórek śródbłonka.
6. Odłącz komórki śródbłonka. Komórki śródbłonka powinny być w 70-90% konfluentne. Usuń pożywkę z naczynia hodowlanego i przepłucz komórki dwukrotnie PBS (D8537). Usuń roztwór myjący i dodaj 50 μL roztworu Accutase (A6964) na cm² powierzchni naczynia. Zamknąć naczynie i inkubować w temperaturze 37°C przez 3-5 minut. Zbadaj komórki pod mikroskopem. Delikatnie uderz w bok naczynia, aby przyspieszyć oderwanie komórek. Gdy około 80% komórek oddzieli się, dodaj 100 μl pożywki na cm² powierzchni naczynia i delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby utworzyć zawiesinę pojedynczych komórek.
7. Liczenie komórek. Przenieś zawiesinę komórek do odpowiedniej probówki wirówkowej i ponownie przepłucz powierzchnię naczynia za pomocą 100 μL pożywki do wzrostu komórek śródbłonka na cm² powierzchni naczynia, aby zebrać pozostałe komórki. Określ liczbę komórek zgodnie ze standardową procedurą.
8. Przygotuj komórki do testu tworzenia rurek. Przygotuj probówki wirówkowe o pojemności 15 ml (po jednej probówce na każdy test) i przenieś 1X10⁵ - 1,5X10⁵ komórek śródbłonka do każdej probówki. Odwirować probówki przy 300 x g przez 3 minuty i ponownie zawiesić każdy osad w 1 ml odpowiedniej pożywki testowej lub kontrolnej.
9. Przygotować komórki do testu formowania rurek. Dodaj 100 μL (= 1X10⁴ - 1,5X10⁴ komórek) każdej pojedynczej zawiesiny komórkowej na studzienkę na wierzchu zżelowanego BME. Uważaj, aby nie dotknąć powierzchni żelu.
10. Inkubować w temperaturze 37 °C. Inkubuj 96-dołkową płytkę w nawilżanym inkubatorze (37 °C, 5% CO₂) przez 4 do 24 godzin. Komórki mogą być monitorowane w pożądanych punktach czasowych przy użyciu odwróconego mikroskopu.

Analiza obrazu formowania się kanalików

(A) Mikroskopia świetlna

Sieć kanalików w studzienkach może być obrazowana bez utrwalania lub znakowania przy użyciu mikroskopu odwróconego (Rys. 2A i C).

(B) Znakowanie kalceiną AM

Przygotuj 6 μM roztworu kalceiny AM (17783) w zalecanej pożywce podstawowej. Dodać 50 μL roztworu na studzienkę bez odsysania pożywki. Inkubować płytkę w nawilżonym inkubatorze (37 °C, 5% CO₂) przez 30 minut. Komórki znakowane kalceiną AM można natychmiast obserwować za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego z filtrem wzbudzenia 485 nm lub emisji 520 nm.

(C) Utrwalanie i barwienie fioletem krystalicznym

Przygotować 0,1% roztwór barwiący fioletu krystalicznego (V5265) w wodzie destylowanej (w/v). Ostrożnie usuń pożywkę ze studzienek i przemyj komórki 100 μL PBS na studzienkę. Usunąć wodę i dodać 100 μL roztworu fioletu krystalicznego na studzienkę. Inkubować płytkę przez 15-30 minut w temperaturze pokojowej. Przemyć komórki dwukrotnie sterylną wodą i zobrazować komórki za pomocą mikroskopu odwróconego (rys. 2D).

Rysunek 2. Test tworzenia rurek w komórkach śródbłonka In vitro. (A) Obraz z mikroskopu świetlnego komórek PromoCell HUVEC hodowanych na ekstrakcie z błony podstawnej przez 17 godzin. (B) Barwienie kalceiną komórek PromoCell HUVEC hodowanych na ekstrakcie z błony podstawnej przez 17 godzin przy użyciu zestawu PromoKine's Angiogenesis Assay Kit. (C) Obraz mikroskopii świetlnej PromoCell HCAECs hodowanych na ekstrakcie z błony podstawnej i stymulowanych 50 ng/ml FGF przez 16 godzin. (D) Barwienie fioletem krystalicznym PromoCell HCAECs hodowanych na BME przez 16 godzin.

Referencje

1. Van Hove AH, Benoit DSW. Depot-Based Delivery Systems for Pro-Angiogenic Peptides: A Review. Front. Bioeng. Biotechnol.. 3 https://doi.org/10.3389/fbioe.2015.00102

2. DeCicco-Skinner KL, Henry GH, Cataisson C, Tabib T, Gwilliam JC, Watson NJ, Bullwinkle EM, Falkenburg L, O'Neill RC, Morin A, et al. Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis. JoVE.(91): https://doi.org/10.3791/51312

3. Adams RH, Alitalo K. 2007. Molecular regulation of angiogenesis and lymphangiogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 8(6):464-478. https://doi.org/10.1038/nrm2183

4. BOUIS D, KUSUMANTO Y, MEIJER C, MULDER N, HOSPERS G. 2006. A review on pro- and anti-angiogenic factors as targets of clinical intervention. Pharmacological Research. 53(2):89-103. https://doi.org/10.1016/j.phrs.2005.10.006

5. Carmeliet P, Jain RK. 2000. Angiogenesis in cancer and other diseases. Nature. 407(6801):249-257. https://doi.org/10.1038/35025220

6. Staton CA, Reed MWR, Brown NJ. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. 90(3):195-221. https://doi.org/10.1111/j.1365-2613.2008.00633.x

7. Kubota Y, Kleinman HK, Martin GR, Lawley TJ. 1988. Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures.. 107(4):1589-1598. https://doi.org/10.1083/jcb.107.4.1589

8. Arnaoutova I, George J, Kleinman HK, Benton G. 2009. The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: state of the science and the art. Angiogenesis. 12(3):267-274. https://doi.org/10.1007/s10456-009-9146-4

9. Arnaoutova I, Kleinman HK. 2010. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nat Protoc. 5(4):628-635. https://doi.org/10.1038/nprot.2010.6

10. Benton G, Arnaoutova I, George J, Kleinman HK, Koblinski J. 2014. Matrigel: From discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research. Advanced Drug Delivery Reviews. 79-803-18. https://doi.org/10.1016/j.addr.2014.06.005

11. Kleinman HK, McGarvey ML, Hassell JR, Star VL, Cannon FB, Laurie GW, Martin GR. 1986. Basement membrane complexes with biological activity. Biochemistry. 25(2):312-318. https://doi.org/10.1021/bi00350a005