Charakterystyka produktów Glutathione Sepharose^®

Sepharose^® High Performance jest zalecana do oczyszczania białek znakowanych GST w wysokiej rozdzielczości, zapewniając ostre piki i skoncentrowany eluent. Sefaroza glutationowa^® Fast Flow doskonale nadaje się do skalowania. Sefaroza glutationowa^® 4B ma wysoką pojemność i jest zalecana do pakowania małych kolumn i innych formatów, w tym oczyszczania wsadowego.

Tabela A2.1 podsumowuje kluczowe właściwości tych trzech nośników do chromatografii Glutathione Sepharose^® a Tabele A2.2 do A2.6 podsumowują właściwości tych samych nośników zapakowanych w kolumny i płytki 96-dołkowe. Więcej informacji można znaleźć w Rozdział 5 (Purification using Glutathione Sepharose^® High Performance, Glutathione Sepharose^® 4 Fast Flow oraz Glutathione Sepharose^® 4B).

Tabela A2.1 Charakterystyka Glutathione Sepharose® High Performance, Glutathione Sepharose® 4 Fast Flow i Glutathione Sepharose® 4B

Charakterystyka	Sepharose® High Performance	Glutathione Sepharose® 4 Fast Flow	Sepharose® 4Glutathione Sepharose® 4 Fast Flow	Glutathione Sepharose® 4B
Matrix	Wysoko usieciowana 6% agaroza	Wysoko usieciowana 4% agaroza	4% agaroza
Średni rozmiar cząstek	34 µm	90 µm	90 µm
Stężenie ligandu	1.5-3.5 mg glutationu/ml pożywki (w oparciu o Gly)	120-320 µmol glutationu/ml pożywki	200-400 µmol glutationu/g przemytej i wysuszonej pożywki
zdolność wiązania1	7 mg rekombinowanego glutationu S-transferazy/mL pożywki	10 mg rekombinowanego glutationu S-transferaza/mL podłoża	25 mg GST z końskiej wątroby/mL podłoża
Zalecana prędkość przepływu2	< 150 cm/h	50-300 cm/h	< 75 cm/h
Stabilność chemiczna	Stabilny w stosunku do wszystkich powszechnie stosowanych buforów wodnych, np.1 M octan, pH 4.0 i 6 M Gua-HCl przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej	Stabilny wobec wszystkich powszechnie stosowanych buforów wodnych, np.1 M octan, pH 4,0 i 6 M Gua-HCl przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej	Stabilny wobec wszystkich powszechnie stosowanych buforów wodnych. Ekspozycja na 0,1 M NaOH, 70% etanol lub 6 M Gua-HCl przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub na 1% (w/v) SDS przez 14 dni nie powoduje znaczącej utraty aktywności.
Stabilność pH	3-12	3-12	4-13
Temperatura przechowywania	4 °C do 30 °C	4 °C do 30 °C	4 °C do 8 °C
Bufor do przechowywania	20% etanol	20% etanol	20% etanol

¹ Wiązanie białek znakowanych GST zależy od wielkości, konformacji i stężenia białka w załadowanej próbce. Wiązanie GST z glutationem jest również zależne od przepływu, a niższe szybkości przepływu często zwiększają zdolność wiązania. Jest to ważne podczas ładowania próbki. Właściwości białka, pH i temperatura, ale także zastosowane media mogą wpływać na zdolność wiązania.
² H₂O w temperaturze pokojowej.

.

Tabela A2.2 Charakterystyka GST MultiTrap 4B

Podłoża do chromatografii	GST MultiTrap 4B: Glutathione Sepharose® 4B
Rozmiar płytki filtracyjnej1	127,8 × 85,5 × 30.6 mm
Materiał płyty filtracyjnej	Polipropylen i polietylen
Pojemność wiązania	GST MultiTrap 4B: Do 0.5 mg białka znakowanego GST/basenik
Produkowalność pomiędzy basenikami2	+/- 10%
Objętość zapakowanego podłoża/basenik	50 µL (500 µL 10% zawiesiny)
Liczba studzienek	96
Prędkość wirowania:	Zależy od wstępnej obróbki próbki i jej właściwości
&          zalecane	100-500 × g
&td>maksymalne	700 × g
Ciśnienie próżni:	Zależy od obróbki wstępnej próbki i właściwości próbki
zalecane	-0.1 do -0,3 bar
maksymalnie	-0.5 bar
stabilność pH	Glutathione Sepharose® 4B: 4-13
Przechowywanie	20% etanol
Temperatura przechowywania	4 °C do 8 °C

¹ Zgodnie z normami ANSI/SBS 1-2004, 3-2004 i 4-2004 (ANSI = American National Standards Institute i SBS = Society for Biomolecular Screening).
² Ilość eluowanych białek docelowych/basenik nie różni się o więcej niż +/- 10% od średniej ilości/basenik dla całej płytki filtracyjnej.

Tabela A2.3 Charakterystyka wstępnie zapakowanych kolumn GSTrap HP, GSTrap FF i GSTrap 4B

Charakterystyka	GSTrap HP	GSTrap FF	GSTrap 4B
Podłoża chromatograficzne	Sepharose® High Performance	Glutathione Sepharose® 4 Fast Flow	Sepharose® 4B
Średni rozmiar cząstek	34 µm	90 µm	90 µm
Dynamiczna zdolność wiązania1,2	Około. 7 mg rGST/ml pożywki	Op. 10 mg rGST/ml pożywki	Op. 25 mg GST z wątroby konia/mL podłoża
Maks. ciśnienie wsteczne3	0,3 MPa, 3 bary	0.3 MPa, 3 bary	0.3 MPa, 3 bary
Zalecana szybkość przepływu3	Ładowanie próbki: 0.2-1 mL/min (1 mL) i 1-5 mL (5 mL) Płukanie i elucja: 1-2 mL/min (1 mL) i 5-10 mL/min (5 mL)	Ładowanie próbki: 0.2-1 mL/min (1 mL) i 1-5 mL (5 mL) Płukanie i elucja: 1-2 mL/min (1 mL) i 5-10 mL/min (5 mL)	Ładowanie próbki: 0.2-1 mL/min (1 mL) i 0.5-5 mL/min (5 mL) Płukanie i elucja: 1 mL/min (1 mL) i 5 mL/min (5 mL)
Stabilność chemiczna	Stabilny wobec wszystkich powszechnie stosowanych buforów wodnych, np.g. 1 M octan, pH 4.0 i 6 M Gua-HCl przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej	Stabilny wobec wszystkich powszechnie stosowanych buforów wodnych, np.1 M octan, pH 6,0 i 6 M Gua-HCl przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej	Stabilny wobec wszystkich powszechnie stosowanych buforów wodnych. Ekspozycja na 0,1 M NaOH, 70% etanol lub 6 M Gua-HCl przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub na 1% (w/v) SDS przez 14 dni nie powoduje znaczącej utraty aktywności.
stabilność pH	3-12	3-12	4-13
Temperatura przechowywania	4 °C do 30 °C	4 °C do 30 °C	4 °C do 8 °C
Bufor do przechowywania	20% etanol	20% etanol	20% etanol

Wymiary kolumn są identyczne dla wszystkich trzech kolumn GSTrap (0,7 × 2,5 cm dla kolumny 1 ml i 1,6 × 2,5 cm dla kolumny 5 ml). Objętości kolumn wynoszą 1 ml i 5 ml.

¹ Wiązanie białek znakowanych GST zależy od wielkości, konformacji i stężenia białka w załadowanej próbce. Wiązanie GST z glutationem jest również zależne od przepływu, a niższe szybkości przepływu często zwiększają zdolność wiązania. Jest to ważne podczas ładowania próbki. Właściwości białka, pH i temperatura, ale także zastosowane medium chromatograficzne mogą wpływać na zdolność wiązania.

² Dynamiczne warunki zdolności wiązania (60% przebicia):

Próbka: Objętość kolumny: Szybkość przepływu: Bufor wiążący: Bufor elucyjny:

1 mg/mL czystego białka znakowanego GST w buforze wiążącym 0.4 ml 0,2 ml/min (60 cm/h) 10 mM fosforan sodu, 140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, pH 7,4 50 mM Tris-HCl, 10 mM zredukowany glutation, pH 8.0

³ H₂O w temperaturze pokojowej.

.

Tabela A2.4 Charakterystyka GSTPrep FF 16/10

Środek chromatograficzny	Sefaroza glutationowa® 4 Fast Flow
Objętość kolumny	20 mL
Wymiary kolumny	1.6 × 10 cm
Dynamiczna zdolność wiązania1,2	Około. 200 mg rGST/kolumnę
Zalecana szybkość przepływu3	1-10 ml/min (30-300 cm/h)
Maks. Przepływ3	10 mL/min (300 cm/h)
Maks. ciśnienie nad złożem upakowanym podczas pracy3	1,5 bara (0,15 MPa, 22 psi)
Graniczne ciśnienie sprzętowe w kolumnie	5 barów (0.5 MPa, 73 psi)
Przechowywanie	20% etanolu
Temperatura przechowywania	4 °C do 30 °C

¹ Wiązanie białek znakowanych GST zależy od wielkości, konformacji i stężenia białka w załadowanej próbce. Wiązanie GST z glutationem jest również zależne od przepływu, a niższe szybkości przepływu często zwiększają zdolność wiązania. Jest to ważne podczas ładowania próbki. Właściwości białka, pH i temperatura, ale także zastosowane medium chromatograficzne mogą wpływać na zdolność wiązania.

² Dynamiczne warunki zdolności wiązania (60% przebicia):

Próbka: Objętość kolumny: Szybkość przepływu: Bufor wiążący: Bufor elucyjny:

1 mg/ml czystego białka znakowanego GST w buforze wiążącym 0.4 ml 0,2 ml/min (60 cm/h) 10 mM fosforan sodu, 140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, pH 7,4 50 mM Tris-HCl, 10 mM zredukowany glutation, pH 8.0

³ H₂O w temperaturze pokojowej.

.

Tabela A2.5 Charakterystyka wstępnie zapakowanych kolumn GST GraviTrap

Kolumna materiał fryty	Beczka polipropylenowa, polietylen
Pojemność kolumny	13 ml
Średnia	Sefaroza glutationowa® 4B
Średni rozmiar kulek	45-165 µm
Ligand	Glutation i 10-węglowe ramię łączące
Stężenie ligandu	7-15 µmol glutationu/mL pożywki
Zdolność wiązania białka1	Około. 50 mg GST z wątroby konia/kolumnę
Objętość złoża	2 mL
Kompatybilność podczas stosowania	Wszystkie powszechnie stosowane bufory wodne
Stabilność chemiczna	Nie wykryto znaczącej utraty pojemności, gdy Glutathione Sepharose® 4B jest wystawiona na działanie 0.1 M cytrynianu (pH 4,0), 0,1 M NaOH, 70% etanolu lub 6 M Gua-HCl2 przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Nie zaobserwowano znaczącej utraty zdolności wiązania po ekspozycji na 1% SDS przez 14 dni.
Roztwór do przechowywania	20% etanol
Stabilność pH	4-13
Temperatura przechowywania	4 °C do 30 °C

Uwaga: Nie zaleca się autoklawowania kolumn.

¹ Zdolność wiązania zależy od białka. Wiązanie białek znakowanych GST zależy od wielkości, konformacji i stężenia białka w próbce. Wiązanie GST z glutationem jest również zależne od przepływu, a niższe szybkości przepływu często zwiększają zdolność wiązania. Jest to ważne podczas ładowania próbki. Właściwości białka, pH i temperatura mogą również wpływać na zdolność wiązania.

² Wystawienie próbki na działanie 6 M Gua-HCl spowoduje denaturację znacznika GST. Dlatego ważne jest, aby usunąć cały Gua-HCl przed użyciem.

Tabela A2.6 Charakterystyka kolumn GST SpinTrap

Materiał kolumny	Beczka z polipropylenu, frytki z polietylenu
Pojemność kolumny	900 µL
Średnia	Sefaroza glutationowa® 4B
Średni rozmiar perełek	90 µm
Ligand	Glutation i 10-węglowe ramię łączące
Stężenie ligandu	7-15 µmol glutationu/mL pożywki
Zdolność wiązania białka1	Około. 500 µg GST z wątroby konia/kolumnę
Objętość złoża	50 µL
Kompatybilność podczas użytkowania	Wszystkie powszechnie stosowane bufory wodne
Stabilność chemiczna	Nie wykryto znaczącej utraty pojemności, gdy Glutathione Sepharose® 4B jest wystawiona na działanie 0.1 M cytrynianu (pH 4,0), 0,1 M NaOH, 70% etanolu lub 6 M Gua-HCl2 przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Nie zaobserwowano znaczącej utraty zdolności wiązania po ekspozycji na 1% SDS przez 14 dni.
Roztwór do przechowywania	PBS i 0.05% Kathon CG/ICP Biocide
stabilność pH	4-13
Temperatura przechowywania	Temperatura pokojowa

¹  Zdolność wiązania zależy od białka. Wiązanie białek znakowanych GST zależy od wielkości, konformacji i stężenia białka w załadowanej próbce. Wiązanie GST z glutationem jest również zależne od przepływu, a niższe szybkości przepływu często zwiększają zdolność wiązania. Jest to ważne podczas ładowania próbki. Właściwości białka, pH i temperatura mogą również wpływać na zdolność wiązania.

²  Wystawienie próbki na działanie 6 M Gua-HCl spowoduje denaturację znacznika GST. Dlatego ważne jest, aby usunąć cały Gua-HCl przed użyciem.