Protokół sprzęgania dla aminy pierwszorzędowej liganda

Sefaroza aktywowana NHS o wysokiej wydajności, Sepharose 4 Fast Flow aktywowana NHS

Sefaroza aktywowana NHS jest przeznaczona do kowalencyjnego przyłączania ligandów (często antygenów lub przeciwciał) zawierających pierwszorzędowe grupy aminowe (najczęstsza forma przyłączania). Matryca wysokowydajnej sefarozy aktywowanej NHS opiera się na silnie usieciowanych kulkach agarozowych z 10-atomowymi ramionami dystansowymi (kwas 6-aminoheksanowy) przyłączonymi przez epichlorohydrynę i aktywowanymi przez N-hydroksysukcynimid (Rysunek 4.2). Matryca aktywowanej NHS Sepharose 4 Fast Flow oparta jest na silnie usieciowanych kulkach agarozowych z 14-atomowymi ramionami dystansowymi. Niespecyficzna adsorpcja białek na aktywowanej NHS sefarozie (która może zmniejszyć zdolność wiązania białka docelowego) jest znikoma ze względu na doskonałe właściwości hydrofilowe matrycy bazowej. Matryca jest stabilna przy wysokim pH, aby umożliwić rygorystyczne procedury mycia (z zastrzeżeniem stabilności pH sprzężonego ligandu)

Rysunek 4.2. Częściowa struktura aktywowanych NHS ramion dystansowych Sepharose High Performance.

Ligandy zawierające grupy aminowe łączą się szybko i spontanicznie poprzez atak nukleofilowy na wiązanie estrowe, dając bardzo stabilne wiązanie amidowe (rysunek 4.3). Wiązanie amidowe jest stabilne do pH 13,0, dzięki czemu sefaroza aktywowana NHS nadaje się do zastosowań wymagających warunków o wysokim pH.

Rysunek 4.3. Sprzęganie ligandu z aktywowaną NHS sefarozą o wysokiej wydajności.

Charakterystyka mediów chromatograficznych

Charakterystykę aktywowanych NHS mediów do chromatografii sefarozowej przedstawiono w tabeli 4.3.

.

Tabela 4.3 Charakterystyka aktywowanych NHS nośników do chromatografii sefarozowej

Produkt	Gęstość ligandu (µmol/mL)	Skład	Stabilność pH1	Średni rozmiar cząstek (µm)
Sepharose High Performance aktywowana NHS	10	Kwas 6-aminoheksanowy połączony przez sprzężenie epoksydowe z Sepharose High Performance, końcowa grupa karboksylowa estryfikowana NHS.	Krótkoterminowe: 3 do 12 Długoterminowe: 3 do 12	34
Sepharose 4 Fast Flow aktywowana NHS	16 do 23	Jak wyżej.	Krótkoterminowe: 3 do 13 Długoterminowe: 3 do 13	90

¹Krótki termin odnosi się do przedziału pH dla procedur regeneracji, czyszczenia na miejscu i odkażania. Dane dotyczące stabilności odnoszą się do sprzężonego medium, pod warunkiem, że ligand może wytrzymać pH. Długoterminowy odnosi się do przedziału pH, w którym matryca jest stabilna przez długi okres czasu bez negatywnego wpływu na jej późniejszą wydajność chromatograficzną.

Opcje chromatografii

Podłoża do chromatografii sefarozowej aktywowane przez NHS i kolumny wstępnie zapakowane opisano w tabeli 4.4.

.

Tabela 4.4. Opcje oczyszczania dla nośników chromatograficznych aktywowanych NHS i kolumn w opakowaniach jednostkowych

Produkt	Ramię dystansowe	Warunki sprzęgania	Maksymalny przepływ roboczy<	Komentarze
HiTrap® NHS-activated HP	10-atom	pH 6.5 do 9,0, 15 do 30 min w temp. pokojowej lub 4 h w temp. 4°C.	4 mL/min (kolumna 1 mL) 20 mL/min (kolumna 5 mL)	Zapakowana kolumna 1 mL. Wstępnie zapakowana kolumna 5 mL.
NHS-aktywowana Sepharose 4 Fast Flow	14-atom	pH 6 do 9, 16 h 4 °C do temp. pokojowej.	300 cm/h	Dostarczana jako zawiesina gotowa do pakowania w kolumnie.

¹ Zobacz Załącznik 4 do konwersji prędkości przepływu (cm/h) na objętościową szybkość przepływu (ml/min). Maksymalny przepływ roboczy jest obliczany na podstawie pomiaru w kolumnie z wypełnieniem o wysokości złoża 10 cm i średnicy wewnętrznej 5 cm.

Rysunek 4.4 pokazuje, że ponad 30 mg IgG może być sprzężone z 1 ml HiTrap^® kolumną HP aktywowaną NHS.Proces sprzęgania trwa mniej niż 15 minut. Pożywka AC jest następnie gotowa do użycia w celu oczyszczenia antygenu.

Rysunek 4.4. Sprzęganie ligandu z HiTrap^® HP aktywowanym NHS.

Przykłady oczyszczania

AC może być stosowany do produkcji przeciwciał monospecific z surowic poliklonalnych. Podejście to zostało zastosowane w projekcie Human Protein Atlas (www.proteinatlas.org) w skali całego proteomu. Przeciwciała poliklonalne zostały wyhodowane u królików dla wszystkich białek kodowanych przez ludzki genom. Każda surowica przeciwciał została oczyszczona przy użyciu kolumn HiTrap^® aktywowanych NHS, na których unieruchomiono epitopy antygenów (rysunek 4.5). Elucję uzyskano poprzez obniżenie pH do 2,5. Wymaganą wysoką przepustowość uzyskano stosując 12 modułów systemu ÄKTA do oczyszczania 48 poliklonalnych surowic odpornościowych dziennie.

Rysunek 4.5. Elucja oczyszczonego przeciwciała z kolumny specyficznej dla antygenu i odsalanie na HiTrap^® Desalting, 5 mL (dzięki uprzejmości projektu Human Protein Atlas).

Przeprowadzanie separacji

HiTrap^® NHS-activated HP

Poniższy protokół opisuje przygotowanie wstępnie zapakowanej kolumny HiTrap^® NHS-activated HP i ma ogólne zastosowanie do nośników do chromatografii sefarozowej aktywowanych NHS.

Aktywowana matryca jest dostarczana w 100% izopropanolu, aby zachować stabilność przed połączeniem. Nie należy wymieniać izopropanolu, dopóki nie nadejdzie czas na sprzężenie ligandu.

Przygotowanie buforu

Sprzęganie w zakresie pH od 6,5 do 9,0, maksymalna wydajność jest osiągana przy pH około 8,0.

Roztwór zakwaszający:	1 mM HCl (przechowywany na lodzie)
Bufor sprzęgający:	200 mM NaHCO3, 500 mM NaCl, pH 8.3
Bufor blokujący:	500 mM etanoloamina, 500 mM NaCl, pH 8.3
Bufor płuczący:	100 mM octan, 500 mM NaCl, pH 4.0

Przygotowanie ligandu i kolumny

1. Rozpuścić ligand w buforze sprzęgającym do końcowego stężenia 0.5 do 10 mg/ml (dla ligandów białkowych) lub przeprowadzić wymianę buforu przy użyciu kolumny odsalającej (Wymiana buforu i odsalanie w Dodatku 1). Optymalne stężenie zależy od ligandu. Rozpuść ligand w jednej objętości buforu w kolumnie.
2. Zdejmij górną nasadkę z kolumny i nałóż kroplę lodowato zimnego 1 mM HCl na górną część kolumny, aby uniknąć pęcherzyków powietrza.
3. Podłącz górną część kolumny do strzykawki lub pompy.
4. Zdejmij zatrzaskową końcówkę.

Sprzęganie ligandów

1. Wymyć izopropanol za pomocą 3 × 2 CV lodowato zimnego 1 mM HCl.
2. Wstrzyknąć 1 CV roztworu ligandu na kolumnę.
3. Zamknąć kolumnę. Pozostawić na 15 do 30 minut w temperaturze 25°C (lub 4 godziny w temperaturze 4°C).

Recyrkulować roztwór, jeśli używane są większe objętości roztworu ligandu. Na przykład, w przypadku użycia strzykawki, podłącz drugą strzykawkę do wylotu kolumny i delikatnie pompuj roztwór tam i z powrotem przez 15 do 30 minut lub, jeśli używasz pompy perystaltycznej, cyrkuluj roztwór ligandu przez kolumnę.

Nie używaj nadmiernych szybkości przepływu. Maksymalne zalecane szybkości przepływu wynoszą 1 ml/min (co odpowiada około 30 kroplom/min przy użyciu strzykawki) w przypadku kolumn HiTrap^® 1 ml. W przypadku kolumn HiTrap^® 5 ml zalecana szybkość przepływu wynosi 5 ml/min (co odpowiada około 120 kroplom/min przy użyciu strzykawki). Zawartość kolumny może zostać nieodwracalnie ściśnięta.

Pomiar wydajności ligandu białkowego poprzez porównanie wartości A280 roztworu ligandu przed i po sprzężeniu. Należy pamiętać, że N-hydroksysukcynimid, uwolniony podczas procedury sprzęgania, silnie absorbuje przy 280 nm i powinien zostać usunięty z roztworu sprzęgającego przed pomiarem stężenia pozostałego ligandu. Do usunięcia N-hydroksysukcynimidu z ligandów białkowych należy użyć małej kolumny odsalającej (Buffer exchange and desalting, Appendix 1). Alternatywne metody pomiaru wydajności sprzęgania opisano w części Zdolność wiązania, gęstość ligandów i wydajność sprzęgania wcześniej w tym rozdziale oraz w HiTrap^® Instrukcji HP aktywowanej NHS.

Płukanie i dezaktywacja

Ta procedura dezaktywuje nadmiar aktywnych grup, które nie połączyły się z ligandem i wypłukuje niespecyficznie związane ligandy.

1. Wstrzyknąć 3 × 2 CV buforu blokującego.
2. Wstrzyknąć 3 × 2 CV buforu płuczącego.
3. Wstrzyknąć 3 × 2 CV buforu blokującego.
4. Odstawić kolumnę na 15 do 30 minut.
5. Wstrzyknąć 3 × 2 CV buforu płuczącego.
6. Wstrzyknąć 3 × 2 CV buforu blokującego.
7. Wstrzyknąć 3 × 2 CV buforu płuczącego.
8. Wstrzyknąć 2 do 5 CV buforu o neutralnym pH.

Kolumna jest teraz gotowa do użycia.

Przechowywanie

Przechowuj kolumnę w roztworze, który utrzymuje stabilność ligandu i zawiera środek bakteriostatyczny.

Stabilność pH medium chromatograficznego po połączeniu z wybranym ligandem będzie zależeć od stabilności samego liganda.

Sefaroza aktywowana CNBr

Sefaroza aktywowana CNBr oferuje ugruntowaną opcję przyłączania większych ligandów i jest alternatywą dla sefarozy aktywowanej NHS.

Bromek cyjanogenu reaguje z grupami hydroksylowymi na sefarozie, tworząc reaktywne cyjanianowe grupy estrowe. Białka, peptydy, aminokwasy lub kwasy nukleinowe mogą być sprzęgane z sefarozą aktywowaną CNBr, w łagodnych warunkach, poprzez pierwszorzędowe grupy aminowe lub podobne grupy nukleofilowe. Aktywowane grupy reagują z pierwszorzędowymi grupami aminowymi na ligandzie, tworząc wiązania izomocznikowe (rysunek 4.6). Reakcja sprzęgania jest spontaniczna i nie wymaga specjalnych środków chemicznych ani sprzętu. Powstałe wielopunktowe wiązanie zapewnia, że ligand nie hydrolizuje z matrycy. Procedura aktywacji sieciuje również Sepharose, a tym samym zwiększa jej stabilność chemiczną, oferując znaczną elastyczność w wyborze warunków elucji.

Rysunek 4.6. Aktywacja bromkiem cyjanogenu i sprzęganie z aktywowaną matrycą.

Charakterystyka mediów chromatograficznych

Charakterystykę mediów do chromatografii sefarozowej aktywowanych CNBr przedstawiono w Tabeli 4.5.

Tabela 4.5.Charakterystyka nośników do chromatografii sefarozowej aktywowanych CNBr

Skład

Produkt	Pojemność wiązania/ml podłoża	Stabilność pH1h	Średni rozmiar cząstek (µm)
Bromek cyjanogenu reaguje z grupami hydroksylowymi na sefarozie, dając reaktywny produkt do sprzęgania ligandów poprzez pierwszorzędowe grupy aminowe lub podobne grupy nukleofilowe.	α-chymotrypsynogen, 13 do 26 mg	Krótkoterminowo: 3 do 11 Długoterminowo: 3 do 11	90
Sepharose 4B aktywowana CNBr	α-chymotrypsynogen, 25 do 60 mg	Krótkoterminowo: 3 do 11 Długoterminowo: 3 do 11	90

¹Krótki termin odnosi się do przedziału pH dla procedur regeneracji, czyszczenia na miejscu i odkażania. Dane dotyczące stabilności odnoszą się do sprzężonego medium, pod warunkiem, że ligand może wytrzymać pH. Długoterminowy odnosi się do przedziału pH, w którym matryca jest stabilna przez długi okres czasu bez negatywnego wpływu na jej późniejszą wydajność chromatograficzną.

Opcje chromatografii

Dostępne nośniki do chromatografii sefarozowej aktywowane CNBr przedstawiono w tabeli 4.6.

.

Tabela 4.6. Opcje oczyszczania mediów do chromatografii sefarozowej aktywowanych CNBr

Produkt	Ramię dystansowe	Warunki połączenia	Maksymalna prędkość robocza fl(cm/h)	Komentarze
Brak	pH 7 do 9; 2 do 16 h; 4 °C do temp. pokojowej.	400	Dostarczany jako liofilizowany proszek.
Sepharose 4B aktywowana CNBr	Brak	pH 8 do 10; 2 do 16 h; 4 °C do temp. pokojowej.	75	Dostarczany jako liofilizowany proszek.

Przykłady oczyszczania

W literaturze można znaleźć wiele przykładów zastosowania sefarozy aktywowanej CNBr. Rysunek 4.7 przedstawia separację natywnej glikoproteiny otoczki zewnętrznej, gp120, z komórek T zakażonych wirusem HIV-1. Aglutynina Galanthus nivalis (GNA), lektyna z cebulki przebiśniegu, została połączona z aktywowaną CNBr Sepharose 4 Fast Flow, aby stworzyć odpowiednie podłoże AC.

Rysunek 4.7. Separacja natywnego białka gp120 na GNA sprzężonym z aktywowaną CNBr Sepharose 4 Fast Flow. Z Gilljam, G. et al., Purification of native gp120 from HIV-1 infected T-cells; plakat zaprezentowany na Recovery of Biological Products VII, San Diego, CA, USA (1994).

Wykonywanie separacji

Przygotowanie buforu

Roztwór do acydyfikacji: 1 mM HCl (przechowywany na lodzie) Bufor sprzęgający: 200 mM NaHCO3, 500 mM NaCl, pH 8,3 Bufor blokujący: 1 M etanoloamina lub 200 mM glicyna, pH 8,0 Bufor płuczący: 100 mM octan, 500 mM NaCl, pH 4.0

Przygotowanie aktywowanej CNBr Sepharose 4 Fast Flow i aktywowanej CNBr Sepharose 4B

1. Zawiesić wymaganą ilość liofilizowanego proszku w lodowatym 1 mM HCl (HCl zachowuje aktywność grup reaktywnych, które hydrolizują przy wysokim pH).
2. Płukać przez 15 minut na filtrze ze szkła spiekanego (porowatość G3), używając łącznie 200 mL 1 mM HCl na gram suchego proszku, dodawanego i usuwanego przez odsysanie w kilku podwielokrotnościach. Ostatnia porcja 1 mM HCl jest usuwana przez odsysanie do momentu pojawienia się pęknięć w cieście.
3. Natychmiast przenieś matrycę do roztworu ligandu.

Przygotowanie matrycy powinno być zakończone bezzwłocznie, ponieważ reaktywne grupy na matrycy hydrolizują przy pH sprzęgania.

Na tym etapie nie należy używać buforów zawierających grupy aminowe, ponieważ będą się one łączyć z matrycą.

Przygotowanie ligandu

Rozpuścić ligand w buforze sprzęgającym do końcowego stężenia 0.5 do 10 mg/ml (dla ligandów białkowych) lub przeprowadzić wymianę buforu przy użyciu kolumny odsalającej (strona 133). Optymalne stężenie zależy od ligandu. Stosunek matryca:bufor powinien wynosić od 1:0,5 do 1:1.

Sprzęganie ligandów

1. Mieszaj roztwór ligandu z zawiesiną w mieszadle typu end-over-end lub podobnym przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4°C. Stosunek matrycy do buforu wynoszący od 1:0,5 do 1:1 daje odpowiednią zawiesinę do sprzęgania.
2. Przenieś medium do buforu blokującego na 16 godzin w temperaturze 4 °C lub 2 godziny w temperaturze pokojowej, aby zablokować wszelkie pozostałe grupy aktywne. Alternatywnie, pozostawić pożywkę na 2 godziny w buforze Tris-HCl, pH 8.0.
3. Usuń nadmiar ligandu i środka blokującego przez naprzemienne przemywanie buforem sprzęgającym, a następnie buforem płuczącym. Powtórzyć cztery lub pięć razy.

Nie używaj mieszadeł magnetycznych, ponieważ mogą one uszkodzić matrycę sefarozową.

Reakcja sprzęgania przebiega najskuteczniej, gdy grupy aminowe na ligandzie są głównie w formie nieprotonowanej. Bufor o pH 8.3 jest najczęściej używany do sprzęgania białek. Wysoka zawartość soli w buforze sprzęgającym minimalizuje adsorpcję białko-białko spowodowaną polielektrolitową naturą białek.

Sprzęganie α-chymotrypsynogenu opisaną tutaj metodą zwykle daje około 90% sprzężonego białka. Konieczne może być zmniejszenie liczby grup sprzęgających na matrycy w celu zachowania struktury miejsc wiązania w labilnej cząsteczce lub ułatwienia elucji, gdy efekty steryczne zmniejszają skuteczność wiązania dużego liganda. Zmniejszoną aktywność sprzęgania można osiągnąć poprzez kontrolowaną hydrolizę aktywowanej matrycy przed sprzęganiem lub poprzez sprzęganie przy niższym pH. Wstępna hydroliza zmniejsza liczbę aktywnych grup dostępnych do sprzęgania i zmniejsza liczbę punktów przyłączenia między białkiem a matrycą, a także ilość sprzężonego białka. W ten sposób można uzyskać wyższą aktywność wiązania produktu. Przy pH 3,0 aktywność sprzęgania jest tracona tylko powoli, podczas gdy przy pH 8,3 aktywność jest tracona dość szybko. Duża cząsteczka jest sprzęgana w około połowie mniejszej liczbie punktów po 4 godzinach prehydrolizy przy pH 8,3 (Rysunek 4.8).

Rysunek 4.8. Zmiana aktywności sprzęgania z czasem wstępnej hydrolizy przy pH 8,3. Aktywowaną CNBr sefarozę 4B przemyto przy pH 3,0 i przeniesiono do 100 mM NaHCO3, pH 8,3 w celu przeprowadzenia wstępnej hydrolizy. Próbki usuwano po różnym czasie i testowano pod kątem aktywności sprzęgania wobec a-chymotrypsynogenu (A) i glicylo-leucyny (B).

IgG jest często sprzęgany przy nieco wyższym pH, na przykład w 200 do 250 mM NaHCO3, 500 mM NaCl, pH 8,5 do 9,0.

Przechowywanie

Przechowywać liofilizowany proszek w temperaturze poniżej 8 °C w suchych warunkach.

Kolumnę należy przechowywać w roztworze, który utrzymuje stabilność ligandu i zawiera środek bakteriostatyczny, 20% etanolu w odpowiednim buforze.

Stabilność pH medium chromatograficznego w połączeniu z wybranym ligandem będzie zależeć od stabilności samego ligandu.

Sposób przechowywania:

Kolumnę należy przechowywać w roztworze, który utrzymuje stabilność ligandu i zawiera środek bakteriostatyczny, 20% etanolu w odpowiednim buforze.