Test enzymatyczny heksokinazy

Cel

Standaryzacja procedury enzymatycznego oznaczania heksokinazy.

Zakres

Ta procedura ma zastosowanie do większości produktów¹ które mają specyfikację oznaczania heksokinazy metodą enzymatyczną.

Definicje

ATP = Adenozyno-5'-Trifosforan
ADP = Adenozyno-5'-Difosforan
G-6-PDH = Dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa
β-NADP = β-fosforan dinukleotydu nikotynamidoadeninowego, forma utleniona
β-NADPH = fosforan dinukleotydu β-nikotynamidoadeninowego, forma zredukowana
6-PG = 6-fosfo-D-glukonian

reakcja

D-Glukoza + ATP    ^Heksokinaza   > 6-fosforan D-glukozy + ADP
6-fosforan D-glukozy + β-NADP   ^G-6-PDH  >6-PG + β-NADPH

Procedura

WARUNKI: T = 25 °C, pH = 7,6, A_340nm, droga światła = 1 cm

METODA: Ciągłe spektrofotometryczne oznaczanie szybkości

ODCZYNNIKI:

Odczynnik A:  50 mM bufor trietanoloaminowy, pH 7.6 w temperaturze 25 °C (bufor). Przygotować 100 ml w wodzie dejonizowanej przy użyciu chlorowodorku trietanoloaminy, nr produktu T1502. Dostosować do pH 7,6 w 25 °C za pomocą 1 M NaOH.

Odczynnik B: 555 mM roztwór D-glukozy (D-glukoza). Przygotować 10 ml odczynnika A, używając bezwodnej D-(+)-glukozy (nr produktu G8270.)

Odczynnik C: 19 mM roztwór 5'-trifosforanu adenozyny (ATP). Przygotuj 10 mL w wodzie dejonizowanej, używając soli disodowej 5' trifosforanu adenozyny (nr produktu A2383).

Odczynnik D: 100 mM roztwór chlorku magnezu (MgCl₂). Przygotować 5 ml w wodzie dejonizowanej, używając roztworu chlorku magnezu (nr produktu M1028.)

Odczynnik E: 14 mM roztwór fosforanu dinukleotydu β-nikotynamidoadeninowego, postać utleniona (β-NADP). Przygotować 10 ml w wodzie dejonizowanej, używając soli sodowej fosforanu dinukleotydu β-nikotynamidoadeninowego (nr produktu N0505, PREPARE FRESH).

Odczynnik F: Roztwór enzymu dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej (G 6 PDH).² Bezpośrednio przed użyciem przygotować roztwór zawierający około 125 jednostek/ml dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej, nr produktu G4134, w zimnym odczynniku A.³

Odczynnik G: Roztwór enzymu heksokinazy. Bezpośrednio przed użyciem przygotować roztwór zawierający 0,5 - 1,0 jednostki/ml heksokinazy w zimnej wodzie dejonizowanej.)

METODA TESTOWA:

    Odmierzyć pipetą (w mililitrach) następujące odczynniki do odpowiednich kuwet:

	.Test	Blank3
Odczynnik A (Bufor)	1.00	1.00
Odczynnik B (D-glukoza)	1.00	1.00
Odczynnik C (ATP)	0.10	0.10
Odczynnik D (MgCl2)	0.20	0.20
Odczynnik E (β-NADP)	0.20	0.20
Odczynnik F (G-6-PDH)	0.02	0.02

Wymieszać przez odwrócenie i wyrównać do 25 °C. Monitorować A_340nm aż do uzyskania stałej wartości, używając odpowiednio termostatowanego spektrofotometru. Następnie dodać:

Woda dejonizowana	------	0.05
Odczynnik G (roztwór enzymu)	0,05	------

 Natychmiast wymieszać przez odwrócenie i rejestrować wzrost A_340nm przez około 5 minut. Uzyskaj ΔA_340nm/minutę, używając maksymalnej szybkości liniowej zarówno dla testu, jak i ślepej próby.

OBLICZENIA:

	Units/mL enzyme =	(ΔA340nm/min Test - ΔA340nm/min Blank)(2.57)(df)
		(6.22)(0.05)

  2,57 = całkowita objętość (w mililitrach) testu
   df = współczynnik rozcieńczenia
   6.22 = milimolarny współczynnik ekstynkcji β-NADPH przy długości fali 340 nm
    0,05 = objętość (w mililitrach) użytego enzymu

	Units/mg solid =	Units/mL enzyme
		mg solid/mL enzyme

	Jednostki/mg białka =	Jednostki/mL enzymu
		mg białka/mL enzymu

DEFINICJA JEDNOSTKI
Jedna jednostka fosforyluje 1,0 μmol D-glukozy na minutę przy pH 7,6 w temperaturze 25 °C.

KONCENTRACJA KOŃCOWA ANALIZY :
W mieszaninie reakcyjnej o objętości 2,57 mL, końcowe stężenia wynoszą 39 mM trietanoloaminy, 216 mM D-glukozy, 0.74 mM adenozyno-5'-trifosforanu, 7,8 mM chlorku magnezu, 1,1 mM fosforanu dinukleotydu β-nikotynamidoadeninowego, 2,5 jednostki dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej i 0,025 - 0,05 jednostki heksokinazy.

Uwagi

1. Tej procedury nie należy stosować do oznaczania aktywności heksokinazy, Nr produktu H3779, heksokinazy, nierozpuszczalnego enzymu przyłączonego do agarozy paciorkowej, Nr produktu. H2005 i Heksokinaza, nierozpuszczalny enzym przyłączony do poliakryloamidu, Nr produktu H8254.
   
2. Definicja jednostki dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej: Jedna jednostka utlenia 1,0 μmol 6-fosforanu D-glukozy do 6-fosfo-D-glukonianu na minutę w obecności β-NADP przy pH 7,4 w temperaturze 25 °C.
   
3. Inne rodzaje dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej mogą zawierać różne ilości heksokinazy jako zanieczyszczenia.Może to powodować wysoki wskaźnik ślepej próby, dlatego konieczne jest, aby G-6-PDH miał niski poziom zanieczyszczeń heksokinazy.

Odniesienie

1. Bergmeyer H, Grassl M, Walter H. 1983. in Methods of Enzymatic Analysis. (Bergmeyer, H.U. ed). 3(II):222-223.