Test enzymatyczny: Oksydaza glukozy

Read about

• Objective
• Scope
• Definitions
• Discussion
• Zobowiązania
• Bezpieczeństwo
• Procedure
• Related Products

1. Objective

Celem niniejszej procedury jest standaryzacja procedury enzymatycznego oznaczania oksydazy glukozy.

2. Zakres

Niniejsza procedura ma zastosowanie do wszystkich produktów, które mają specyfikację dla aktywności oksydazy glukozy.

3. Definicje

• Woda oczyszczona - woda z systemu dejonizacyjnego, rezystywność > lub = 18MΩ-cm w 25 °C<
• GO = oksydaza glukozy
• POD = peroksydaza
• Definicja jednostki oksydazy glukozy = jedna jednostka utlenia 1.0 μMol β-D-glukozy do D-glukonolaktonu i H₂O₂ na minutę przy pH 5,1 w temperaturze 35 °C (co odpowiada poborowi O₂ wynoszącemu 22,4 μL na minutę). Jeśli mieszanina reakcyjna jest nasycona tlenem, aktywność może wzrosnąć nawet o 100%.

4. Dyskusja

• β -D-Glukoza + O2 + H₂O   ^GO   > D-Glukono -1,5 - Lakton + H₂O₂
• H₂O₂ + o-Dianizydyna(zredukowana)   ^{POD    nbsp;}> o-Dianisidine(oxidized)

5. Obowiązki

Personel służb analitycznych powinien postępować zgodnie z niniejszym protokołem.

6. Bezpieczeństwo

Zwróć uwagę na kartę charakterystyki substancji niebezpiecznej (SDS), aby zapoznać się z zagrożeniami i odpowiednimi środkami ostrożności.

7. Procedura

Warunki

T=35 °C, pH= 5.1, A, droga światła=1 cm

Metoda

Ciągłe spektrofotometryczne oznaczanie szybkości

Odczynniki

• 50 mM bufor octanu sodu, pH 5.1 w temperaturze 35 °C (bufor): Przygotuj 500 ml w oczyszczonej wodzie nasyconej tlenem (nasycaj wodę przez pięć minut i pozostaw na noc przed wykonaniem testu), używając trójwodzianu octanu sodu (nr produktu S8625). Dostosować do pH 5,1 w temperaturze 35 °C za pomocą 1 M HCL.)
• 0.21 mM roztwór o-dianizydyny (o-DDH): Rozpuścić 20 mg o dichlorowodorku dianizydyny  (Nr produktu. D9154) lub (Nr produktu  F5803) w 8 ml oczyszczonej wody nasyconej tlenem, używając bursztynowej fiolki lub innej fiolki chronionej przed światłem. Następnie rozcieńczyć 5,35 ml do 200 ml 50 mM buforem octanu sodu, pH 5.1 w temperaturze 35 °C (bufor).
• 10% (w/v) roztwór substratu β-D-(+) glukozy: Przygotuj 60 ml w oczyszczonej wodzie przy użyciu β-D-(+) glukozy.
• 0,17 mM o-dianizydyny i 1,72% (w/v) roztwór glukozy (Koktajl reakcyjny): Bezpośrednio przed użyciem przygotować 232 mL łącząc 192 mL  0.21 mM roztworu o-dianizydyny (o-DDH) z 40 mL 10% (w/v) roztworu substratu β-D-(+) glukozy. Wyrównać do 35 °C i w razie potrzeby dostosować do pH 5,1 za pomocą 1 M HCL. Przygotować świeży roztwór.
• Roztwór enzymu peroksydazy (POD): Bezpośrednio przed użyciem przygotować roztwór zawierający 60 jednostek purpurogaliny/ml POD typu II w zimnej oczyszczonej wodzie.
• Roztwór enzymu oksydazy glukozy (GO): Dla wszystkich produktów oksydazy glukozy (z wyjątkiem produktów surowych i płynnych) przygotuj początkowy roztwór 20-40 jednostek/ml w zimnym buforze, a bezpośrednio przed użyciem rozcieńcz do 0,4-0,8 jednostek/ml w zimnym buforze (jest to czas zerowy). Roztwór początkowy należy przechowywać na lodzie. Wykonaj drugie świeże rozcieńczenie w zimnym buforze i uruchom ponownie po 60 minutach (jest to czas 60 min). Dla wszystkich surowych i płynnych produktów patrz tabela poniżej.

Produkty ropopochodne i ciecze	Pierwsze rozcieńczenie	Drugie rozcieńczenie
G1262	0.2 mg/ml	Nie wymaga dalszego rozcieńczania
G6766	0.2 mg/ml	Nie wymaga dalszego rozcieńczania
G6125	2.0 mg/ml	0.1 mL+6.4 mL Buffer
G6641	1.0 mg/mL	0.1 mL+5.0 mL Buffer
G9010	0.1 mL+5.0 mL Buffer	0.1 ml+3.0 mL Buffer
G2133	0.1 mg/mL	0.1 mL+5.0 mL Buffer
G7016	0.2 mg/mL	0.1 mL+5.0 mL Buffer
G7141	0.1 mg/ml	0.1 mL+5.0 mL Buffer
G7779 (1.0 mg/ml)	0.1 mL+0.5 mL Buffer	0.1 mL+5.0 mL buforu
G7779 (0.01 mg /mL)	Neat	1.0 mL+3.0 mL buforu

Metoda testowa

Dozuj pipetą następujące odczynniki do odpowiednich kuwet:

	Test	Blank
0.17 mM o-dianizydyny i 1,72% (w/v) roztwór glukozy (koktajl reakcyjny)	2,9	2.9
Roztwór enzymu peroksydazy (POD)	0,1	0,1

Następnie dodaj:

Roztwór enzymu oksydazy glukozy (GO)	0.1	-----
50 mM bufor octanu sodu, pH 5.1 w 35 °C (Bufor)	-----	0.1

Natychmiast wymieszać przez odwrócenie i rejestrować wzrost A_500nm/min przez sześć minut. Uzyskaj maksymalną szybkość liniową zarówno dla testu, jak i ślepej próby, stosując minimalny okres 1,0 minuty i co najmniej cztery punkty A_500nm .

Obliczenia

.

Jednostki/mL enzymu =	(ΔA500nm/minTest - ΔA500nm/ min Blank) * (3.1) * (df)
	(7.5) * (0.1)

3.1=objętość (w mililitrach) testu
df=Współczynnik rozcieńczenia
7.5=Milimolarny współczynnik ekstynkcji utlenionej o-dianizydyny przy 500 nM
0.1=Objętość (w mililitrach) użytego enzymu

	Units/mg solid =	Units/mL enzyme
		mg solid/mL enzyme

	Jednostki/mg białka =	Jednostki/mL enzymu
		mg białka/mL enzymu

Końcowe stężenie testu

W mieszaninie reakcyjnej o objętości 3,10 ml końcowe stężenia wynoszą 48 mM octanu sodu, 0,16 mM o-dianizydyny, 1.61% (w/v) glukozy i 6 jednostek peroksydazy (stężenie oksydazy glukozy będzie się różnić w zależności od używanego produktu).