Metody hodowli hematopoetycznych komórek macierzystych

Hematopoetyczne komórki macierzyste rezydujące w szpiku kostnym myszy zostały po raz pierwszy odkryte przez Tilla i McCullocha w latach sześćdziesiątych XX wieku i wskazały, że (1) hematopoeza może być badana jako nauka ilościowa, (2) w szpiku istniały klonalne komórki krwiotwórcze, które mogły dać początek mieszanemu potomstwu szpikowemu (granulocyty, makrofagi, krwinki czerwone, megakariocyty), (3) niektóre z tych komórek mogły się samoczynnie odnawiać i (4) w śledzionach tych myszy istniały komórki, które mogły również wytwarzać limfocyty. Cała aktywność tworzenia kolonii ludzkich komórek szpiku kostnego (BM) znajduje się we frakcji komórek progenitorowych CD34+. Badania kliniczne dotyczące przeszczepów, w których wykorzystano wzbogacone komórki CD34+ ze szpiku kostnego, pępowiny i jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMC), wykazały obecność HSC o długotrwałej zdolności do rekonstytucji tkanek. Poniżej przedstawiono powszechnie stosowane protokoły i testy hodowli komórkowej in vitro stosowane do izolacji, ekspansji, różnicowania i charakterystyki populacji ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych CD34+ z różnych tkanek.

Izolacja ludzkich hematopoetycznych komórek progenitorowych CD34+

HSC mogą być izolowane przy użyciu cytometrii przepływowej w oparciu o ekspresję markerów powierzchniowych. Pierwotne multipotencjalne hematopoetyczne komórki progenitorowe mają fenotypy z CD34+/CD38-/CD45RA-/CD71- ekspresja. Inne pozytywne markery progenitorów hematopoetycznych obejmują CD133+, CD90+ (Thy-1), ALDH+ oraz Sca-1+. Inne negatywne markery dla progenitorów hematopoetycznych obejmują markery dojrzałej linii krwi (Lin-): CD2-, CD3-, CD19-, CD41-, CD16-, CD14-, oraz CD15-. Idealną próbką jest świeża, antykoagulowana krew lub próbki tkanek. Szczegóły przygotowania różnią się w zależności od konkretnego źródła tkanki. Jeśli próbki nie mogą być przetworzone w ciągu 48 godzin, należy je zamrozić.

1. Próbki rozcieńczyć w stosunku 1:1 w D-PBS bez Mg2+ lub Ca2+ (D8537).
2. Wlej 20 ml Ficoll (F5415) do probówki o pojemności 50 ml i powoli nałóż warstwę (przechylając probówkę i przesuwając komórki po boku probówki) 25 ml rozcieńczonej krwi lub szpiku.
3. Wiruj w temperaturze pokojowej 1100g przez 20 minut.
4. Usuń połowę górnej warstwy i wyrzuć.
5. Ostrożnie odmierz pipetą "mętną" warstwę pośrednią (~10 ml) i przenieś do czystej probówki o pojemności 50 ml. Przemyć komórki 50 ml PBS bez Mg2+ i Ca2+ (D8537).
6. Zawiesić komórki w pożywce z surowicą lub białkiem (D-PBS lub Hank's z 2-6% FBS lub HSA).
7. Wiruj komórki i przepłucz dwukrotnie w D-PBS bez Mg2+ i Ca2+ (D8537).
8. Lizy i usuń RBC przez ponowne zawieszenie w zimnym roztworze NH₄Cl (A9434) w ilości 3-4 razy większej niż oryginalna objętość próbki.
9. Inkubować na lodzie przez 10 minut.
10. Wirować komórki i przemyć dwukrotnie w D-PBS bez Mg2+ i Ca2+ (D8537). Zawiesić komórki w pożywce z surowicą lub białkiem (D-PBS lub Hank's z 2-6% FBS lub HSA).
11. Zawieś ponownie komórki w pożywce Hanka + FBS w stężeniu 10⁷/ml.
12. Pobierz próbki komórek do kontroli (~10⁵ komórek/ probówkę) w następujący sposób: niebarwione komórki; nieistotne kontrole przeciwciał dla FITC, fikoerytryny i Cy5; jednokolorowe kontrole pozytywne dla FITC, fikoerytryny i Cy5.
13. Do pozostałych komórek dodaj odpowiednie przeciwciała dla wybranej procedury. Inkubować komórki przez 30 minut w temperaturze 4°C.
14. Komórki umyć dwukrotnie i ponownie zawiesić w roztworze Hanka + FBS zawierającym 2 µg/ml jodku propidium (PI) (P4170). Komórki są teraz gotowe do sortowania.
15. Przed włączeniem systemu fluidalnego, usuń filtr płynu i użyj strzykawki i tępej igły, aby wstrzyknąć wystarczającą objętość przefiltrowanego 10% wybielacza (425044), aby zalać linię próbkowania.
16. Wyjmij strzykawkę, podłącz nowy, czysty filtr i ponownie zmontuj układ hydrauliczny.
17. Włącz system fluidalny i przeprowadź próbówkę z przefiltrowanym 10% wybielaczem przez około 10 minut.
18. Wyjmij próbówkę z wybielaczem i przepłucz linię próbkowania sterylnym płynem do osłonek.
19. Przepłucz zewnętrzną część linii próbkowania alkoholem, a następnie sterylnym D-PBS. Komórki są selekcjonowane na podstawie rozpraszania do przodu i na boki oraz barwienia PI (komórki żywotne PI). Komórki są następnie sortowane pod kątem wysokiej ekspresji CD34 i niskiej ekspresji CD45, CD38 i CD71.

.

Rysunek 1. Markery ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych analizowane za pomocą cytometrii przepływowej. Charakterystyka cytometryczna ekspansji HSC w skali laboratoryjnej od różnych dawców ujawnia, że Stemline™ Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium generuje znaczną ekspansję zarówno zaangażowanych (niebieski, CD34-/CD15+/CD41+), jak i wczesnych (czerwony, CD34+/CD15-/CD41-) hematopoetycznych komórek progenitorowych.

Ekspansja ludzkich hematopoetycznych komórek progenitorowych CD34+

1. Przygotuj pożywkę do hodowli komórek. Połączyć Basal Medium i Supplement Mix z PromoCell HPC Expansion Medium DXF (C-28021) zgodnie z instrukcją. Następnie dodaj odpowiednią ilość PromoCell Cytokine Mix E (C-39890/C-39891), aby uzyskać całkowicie uzupełnione Expansion Medium. Wstępnie wyrównać odpowiednią ilość uzupełnionej pożywki w inkubatorze w temperaturze 37°C i 5% CO₂ przez 30 minut.
   
2. Płytkować komórki. Świeżo wyizolowane HPC: Umieścić HPC we wstępnie wyrównanej pożywce w gęstości 5X10³ komórek/ml. Kriokonserwowane HPC: Rozmrażać komórki przez 2 minuty w łaźni wodnej. Po rozmrożeniu natychmiast przenieś je do wstępnie wyrównanej pożywki w gęstości 5000 komórek na ml. Użyj co najmniej 9 ml pożywki na fiolkę z kriokonserwowanymi komórkami.
3. Inkubuj komórki przez 4 dni w temperaturze 37°C i 5% CO₂. W celu częściowej wymiany pożywki należy wyjąć komórki z inkubatora. Aby utworzyć zawiesinę pojedynczych komórek, kilkakrotnie pipetuj w górę i w dół i przenieś całą zawartość naczynia do hodowli tkankowej do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Wirować komórki przez 10 minut z prędkością 240 x g. Następnie ostrożnie odessać górne dwie trzecie pożywki. Delikatnie ponownie zawiesić komórki w pozostałej jednej trzeciej pożywki i uzupełnić do pierwotnej objętości świeżą pożywką HPC Expansion Medium DXF uzupełnioną cytokinami (C-28021). Inkubować przez kolejne 6-8 dni, aby umożliwić wystarczającą ekspansję komórek. Wymieniaj dwie trzecie pożywki zgodnie z powyższym opisem co 3 dni.
4. Zbierz komórki zbierając pożywkę z naczynia do hodowli tkankowej zawierającego ekspandowane HPC. Pipetować kilka razy w górę i w dół w celu uwolnienia luźno połączonych komórek i uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek. Wiruj zebrane HPC z prędkością 240 x g przez 10 minut i odrzuć supernatant.
5. Zawieś ponownie komórki w PromoCell HPCs Expansion Medium DXF (C-28021) i policz je. HPC są teraz gotowe do użycia w eksperymentach.

Rysunek 2. Morfologia ludzkich hematopoetycznych komórek progenitorowych CD34+. Hodowla zawiesinowa izolowanych ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych CD34+/CD38 pochodzących ze szpiku kostnego (A, 10X i B, 40X).

Test komórek tworzących kolonie (CFU)

Test komórek tworzących kolonie (CFU) lub test CFC jest używany do badania proliferacji i różnicowania progenitorów hematopoetycznych poprzez ich zdolność do tworzenia kolonii w półstałym podłożu, takim jak metyloceluloza lub agar. Liczba i morfologia kolonii utworzonych przez ustaloną liczbę komórek wejściowych dostarcza wstępnych informacji na temat zdolności progenitorów do różnicowania i proliferacji. Test ten jest przydatny do oceny różnicowania komórek szpikowych (granulocytarnych, monocytarnych, erytroidalnych i megakariocytarnych), ale nie limfoidalnych.

1. Szybko rozmrozić fiolkę z zamrożonymi hematopoetycznymi komórkami macierzystymi CD34+ (C-12921) w temperaturze 37°C lub użyć świeżo wyizolowanych komórek.
2. Przenieść 3X10³ komórek do sterylnej mikroprobówki zawierającej zimny 2% FBS/IMDM. Wstępnie dostosować objętość 2% FBS/IMDM tak, aby końcowa objętość zawiesiny wynosiła około 0,3 ml.
3. Zawiesić komórki i przenieść całą zawiesinę komórek o objętości 0,3 ml do 3 ml porcji rozmrożonego i uzupełnionego Hematopoietic Progenitor Expansion Medium DXF (C-28021). Na tym etapie można dodać dodatkową metylocelulozę (1%) (M7027) i dodatkowe cytokiny w celu indukcji różnicowania linii.
   
4. Wiruj energicznie i pozostaw probówkę nieruchomo przez 3 minuty (pęcherzyki powinny unieść się do góry).
5. Podłącz 16-stopniową igłę z tępym końcem do strzykawki o pojemności 3 ml i pobierz 2,2 ml. Nie zasysaj dużych pęcherzyków; usuń je na początku, wypychając kilka razy. Wyciśnij po 1,1 ml do dwóch 30 mm nietraktowanych płytek i rozprowadź mieszaninę równomiernie poprzez wirowanie i obracanie płytki.
6. Umieść zduplikowane płytki w 100 mm płytce wraz z naczyniem z wodą zawierającym 3 ml sterylnej wody dla dodatkowej wilgotności. Hoduj przez 14-17 dni.
7. Charakteryzuj i oceniaj kolonie zgodnie z ich morfologią za pomocą odwróconego mikroskopu przy 40-krotnym powiększeniu w naczyniu hodowlanym oznaczonym siatką punktacji.
8. Do dalszej analizy różnicowania i proliferacji komórki z całej płytki testowej CFU można odzyskać przez zawieszenie w kilku objętościach 2% FBS/IMDM o temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4°C, komórki są ponownie zawieszane w 2% FBS/IMDM, liczone i barwione przeciwciałami do cytometrii przepływowej lub przenoszone na szkiełka przy użyciu wirówki Cytospin do barwienia Giemsa.

.

Rysunek 3. Wyniki testu tworzenia kolonii (CFU) ludzkich hematopoetycznych komórek progenitorowych CD34+. A) Ludzkie hematopoetyczne komórki macierzyste CD34+ wyizolowane z normalnego, zdrowego ludzkiego szpiku kostnego hodowano w pożywce Stemline™ HSC w metylocelulozie z Epo lub w pożywce konkurencyjnej w metylocelulozie z Epo. Hodowle oceniano po 12-16 dniach hodowli przy użyciu mikroskopu odwróconego. Hodowle oceniano pod kątem jednostek erytroidalnych (BFU-E), jednostek tworzących kolonie granulocytów i monocytów (CFU-GM) oraz jednostek tworzących kolonie granulocytów, erytrocytów, makrofagów i megakariocytów (CFU-GEMM). B) Zróżnicowane ludzkie hematopoetyczne komórki progenitorowe CD34+ wykazujące ludzką kolonię granulopoetyczną zawierającą klonogenne prekursory granulocytów i makrofagów (CFU-GM) oraz ludzką kolonię progenitorową erytroidalną (BFU-E). Kolonie CFU-GM wykazują stosunkowo jednorodną morfologię i zazwyczaj mają skoncentrowany centralny rdzeń komórek otoczony mniej gęstą otoczką komórek. Kolonie BFU-E są często określane jako posiadające morfologię przypominającą winogrona i różnią się wielkością od pojedynczego, dużego skupiska zawierającego kilkaset erytroblastów do 14 lub więcej skupisk zawierających tysiące komórek (powiększenie 40x).