CT01-5

MTT Reagente A

Useful in the study of cell & mitochondrial health, MTT is a pale yellow substrate that is cleaved by living cells to yield a dark blue formazan product.

• Sinonimo/i: MTT Formazan Assay
• Codice UNSPSC: 12352207
• eCl@ss: 32161000
• NACRES: NA.32

Proprietà

• Livello qualitativo: 100
• Forma fisica: solid
• Produttore/marchio commerciale: Chemicon^®
• tecniche: activity assay: suitable; cell based assay: suitable
• Condizioni di spedizione: wet ice

Descrizione

Descrizione generale

Reagente A: MTT, (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro), 50 mg/provetta.

L'MTT è un substrato giallo pallido che nelle cellule vive viene scisso con produzione del composto formazano, di colore blu scuro. Questo processo richiede la presenza di mitocondri attivi mentre immediatamente dopo la morte le cellule non sono più in grado di produrre quantità significative di MTT. Il reagente A è uno dei componenti del kit di analisi basato sull′uso di MTT di Chemicon. Num. Cat. CT01/CT02.

Applicazioni

Procedura:
1. Effettuare i saggi con linfochine e mitogeni o l′analisi della citotossicità complemento-mediata utilizzando i metodi standard, in piastre per colture tissutali a fondo piatto da 96 pozzetti e dotate di una buona qualità ottica (ad es. Falcon). Il volume finale del terreno di coltura in ciascun pozzetto deve essere di 0,1 mL e il terreno (ad es. RPMI o DMEM) può contenere fino al 10% di siero fetale bovino.

2. Alla fine dell'analisi aggiungere 0,01 mL di soluzione AB (MTT) a ciascun pozzetto. Mescolare picchiettando delicatamente sul bordo della piastra.

3. Incubare a 37°C per consentire la scissione dell′MTT a formare formazano Il tempo di incubazione ottimale varia da saggio saggio, nella maggior parte dei casi sono sufficienti quattro ore. Al termine dell′incubazione, il formazano prodotto nei pozzetti contenenti le cellule vive apparirà sotto forma di depositi di cristalli neri.

4. Aggiungere 0,1 mL di soluzione C a ciascun pozzetto. Miscelare accuratamente pipettando ripetutamente con una pipetta multicanale. L'HCl fa virare il rosso fenolo del terreno al giallo, un colore che non interferisce con la misurazione del formazano. L'isopropanolo dissolve il formazano, si ottiene così una soluzione blu omogenea, adatta per la misurazione dell'assorbanza.

5. L′assorbanza va misurata con un lettore di piastre ELISA entro un ora, a 570nm, usando una lunghezza d′onda di 630 nm come riferimento. Dopo alcune ore a temperatura ambiente, le proteine del siero potrebbero iniziare a precipitare a causa della presenza dell′acido/alcool. Il raffreddamento delle piastre ha l′effetto di accelerare la precipitazione. Nel caso la misurazione non venga fatta subito, mantenere le piastre a 4° C prima di aggiungere l'acido/alcool, quindi lasciarle riscaldare a temperatura ambiente e aggiungere l'acido/alcool appena prima della lettura.

Risultati:
Normalmente il test MTT è in grado di rilevare 200-50,000 cellule di una comune linea cellulare anche se l'intervallo utile al test è compreso tra 1,000 e 50,000 cellule. Questo intervallo può variare a seconda del tipo di cellule in esame. I saggi di citotossicità devono essere settati in modo che il controllo (cellule non lisate) dia un segnale compreso tra 0,2 e 0,4 mentre nel caso dei saggi di proliferazione tale valore dovrebbe essere raggiunto alle concentrazioni di plateau. Nel caso di una comune linea cellulare ciò corrisponde a circa 20-50,000 cellule per pozzetto.

L′assorbanza è direttamente proporzionale al numero di cellule; le cellule di per se non assorbono in modo significativo, anche fino a concentrazioni di l x 10⁶ cellule/mL.

Note legali

CHEMICON is a registered trademark of Merck KGaA, Darmstadt, Germany

Informazioni sulla sicurezza

• Pittogrammi: GHS08,GHS07
• Avvertenze: Warning
• Indicazioni di pericolo: H315,H319,H335,H341
• Consigli di prudenza: P201 - P202 - P261 - P302 + P352 - P305 + P351 + P338 - P308 + P313
• Classi di pericolo: Eye Irrit. 2 - Muta. 2 - Skin Irrit. 2 - STOT SE 3
• Organi bersaglio: Respiratory system
• Codice della classe di stoccaggio: 11 - Combustible Solids
• Classe di pericolosità dell'acqua (WGK): WGK 3
• Punto d’infiammabilità (°F): Not applicable
• Punto d’infiammabilità (°C): Not applicable