Lipopolisacharydy

Glycobiology Analysis Manual, 2nd Edition

Lipopolisacharyd (LPS) jest głównym składnikiem zewnętrznej błony bakterii Gram-ujemnych. Lipopolisacharyd jest zlokalizowany w zewnętrznej warstwie błony i jest, w szczepach niekapsułkowanych, eksponowany na powierzchni komórki.

Struktura

Nieaktywne lipopolisacharydy bakteryjne są makrocząsteczkami o masie cząsteczkowej 10-20 kDa składającymi się z trzech składników strukturalnych
(Rysunek 1):

• hydrofobowej części lipidowej, lipidu A, która odpowiada za toksyczne właściwości cząsteczki,
  
• hydrofilowy rdzeniowy łańcuch polisacharydowy oraz
  
• powtarzający się hydrofilowy O-antygenowy oligosacharydowy łańcuch boczny, który jest specyficzny dla serotypu bakterii.¹

Rysunek 1. Ogólna struktura lipopolisacharydów bakteryjnych. Szczegółowe wyjaśnienia dotyczące każdej sekcji znajdują się w tekście. Skróty: KDO: Kwas 3-deoksy-α-D-mannooktulozonowy; Hep: Heptuloza (ketoheptoza); NGa: Galaktozamina; NGc: Glukozamina.

Rdzeń lipidowy A składa się z zasady β-glukozamino-(1→6)-glukozamino-1-fosforanowej z estrami kwasów tłuszczowych przyłączonymi do obu węglowodanów. Długość łańcucha acylowego i liczba grup acylowych mogą się różnić między gatunkami bakterii, ale są względnie zachowane w obrębie gatunku. Wewnętrzny rdzeń polisacharydowy zawiera zazwyczaj od 1 do 4 cząsteczek KDO (kwas 3-deoksy-α-D-manno-oktulozonowy) przyłączonych do rdzenia disacharydowego. KDO jest specyficznie związany z lipopolisacharydem, a uważano, że biologicznie aktywny lipid A wymaga co najmniej jednej reszty KDO do przeżycia bakterii.² Jednak szczep supresorowy Escherichia coli K-12 z niedoborem KDO pokazuje, że wymóg KDO nie jest bezwzględny dla żywotności.³

Wewnętrzny rdzeń zawierający KDO jest również modyfikowany monosacharydami heptulozy (ketoheptozy), z których najczęstszym jest L-glicero-α-D-manno-heptopiranoza. Reszty glikanu rdzenia wewnętrznego są zazwyczaj fosforylowane lub modyfikowane grupami zawierającymi fosforany, np. pirofosforanem lub 2-aminoetylofosforanem. Grupy fosforanowe lipopolisacharydów zwiększają ogólny ładunek ujemny błony komórkowej i pomagają stabilizować strukturę.

Zewnętrzny rdzeń lipopolisacharydu zawiera bardziej powszechne heksozy, w tym glukozę, galaktozę i N-acetyloglukozaminę i jest strukturalnie bardziej zróżnicowany niż rdzeń wewnętrzny.

O-antygen jest powtarzającą się jednostką oligosacharydową, zwykle składającą się z dwóch do sześciu cukrów. O-antygen jest podstawowym składnikiem strukturalnym lipopolisacharydu, który różnicuje bakterie. Charakterystyczne struktury antygenu O zostały wykorzystane do identyfikacji i przypisania grup serologicznych do Escherichia coli, Salmonella enterica i Vibrio cholerae.⁴ Lipopolisacharydy z szorstkich zmutowanych szczepów E. coli brakuje części struktury antygenu O.

Sekcja rdzenia i sekcja lipidowa A lipopolisacharydu mogą mieć pewną zmienność struktury, podczas gdy antygen O ma wysoki stopień zmienności strukturalnej, a także zmienność liczby powtarzających się jednostek. Różnice te powodują znaczną niejednorodność preparatów LPS. Ponieważ LPS jest heterogeniczny i ma tendencję do tworzenia agregatów o różnej wielkości, zgłaszany jest zakres "masy cząsteczkowej" dla tych agregatów wynoszący 1-4 milionów Daltonów lub więcej. Gdy LPS jest traktowany dodecylosiarczanem sodu (SDS) i ciepłem, masa cząsteczkowa wynosi ~50-100 kDa.⁵

Funkcje i zastosowania

W bakteriach Gram-ujemnych lipopolisacharydy błonowe chronią bakterię przed działaniem soli żółciowych i lipofilowych antybiotyków.⁶

Lipopolisacharydy są endotoksynami stabilnymi termicznie i od dawna są uznawane za kluczowy czynnik wstrząsu septycznego (posocznicy) u ludzi^1,7 oraz, bardziej ogólnie, w indukowaniu silnej odpowiedzi immunologicznej w normalnych komórkach ssaków. Cząsteczka lipidowa A została zidentyfikowana jako krytyczna dla aktywności endotoksyny lipopolisacharydu. Zostało to wykazane przez Galanos i in, stwierdzając identyczne wyniki bioaktywne, w tym aktywność endotoksyczną, między syntetycznymi i pochodzącymi z naturalnych źródeł E. coli preparatami lipidu A.⁸ Aktywny receptor dla lipopolisacharydu został zidentyfikowany jako kompleks receptora CD14/TLR4/MD2, który promuje wydzielanie cytokin prozapalnych, w tym czynnika martwicy nowotworów-α i interleukiny-1.⁹ Podczas gdy składnik lipidowy A jest głównie odpowiedzialny za aktywację odpowiedzi immunologicznej, składnik polisacharydowy Salmonella enterica LPS jest również niezbędny do aktywacji NF-κB.¹⁰

Preparaty lipopolisacharydowe zostały wykorzystane w badaniach w celu wyjaśnienia struktury LPS,¹¹ metabolizmu,¹² immunologii,¹³ fizjologii,¹⁴ toksyczności,¹⁵ i biosyntezy.¹⁶ Zostały one również wykorzystane do indukowania syntezy i wydzielania czynników promujących wzrost, takich jak interleukiny.^17,18 Ze względu na jego związek z posocznicą, lipopolisacharyd został zbadany w celu zidentyfikowania możliwych celów dla przeciwciał i inhibitorów biosyntezy LPS.^19,20

Ekstrakcja i oczyszczanie

Lipopolisacharydy można przygotować poprzez ekstrakcję z TCA,²¹ fenolu,^22,23 lub eteru fenolowo-chloroformowo-olejowego (dla szczepów szorstkich).²⁴ Lipopolisacharydy ekstrahowane TCA są strukturalnie podobne do tych ekstrahowanych fenolem, z podobnymi wzorami elektroforetycznymi i endotoksycznością. Podstawowe różnice dotyczą ilości kwasów nukleinowych i zanieczyszczeń białkowych pozostałych po ekstrakcji. Ekstrakty TCA zawierają ~2% RNA i ~10% zdenaturowanych białek, podczas gdy ekstrakty fenolowe zawierają do 60% RNA i <1% białka. Późniejsze oczyszczanie za pomocą chromatografii z filtracją żelową usuwa znaczną część białka obecnego w LPS ekstrahowanym fenolem, ale daje preparat zawierający 10-20% kwasów nukleinowych. Dalsze oczyszczanie przy użyciu chromatografii jonowymiennej daje produkt lipopolisacharydowy, który zawiera <1% białka i <1% RNA.

Referencje

1. Rietschel ET, Kirikae T, Schade FU, Mamat U, Schmidt G, Loppnow H, Ulmer AJ, Zähringer U, Seydel U, Di Padova F, et al. 1994. Bacterial endotoxin: molecular relationships of structure to activity and function. FASEB j.. 8(2):217-225. https://doi.org/10.1096/fasebj.8.2.8119492

2. HELANDER IM, LINDNER B, BRADE H, ALTMANN K, LINDBERG AA, RIETSCHEL ET, ZAHRINGER U. 1988. Chemical structure of the lipopolysaccharide of Haemophilus influenzae strain I-69 Rd-/b+. Description of a novel deep-rough chemotype. Eur J Biochem. 177(3):483-492. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1988.tb14398.x

3. Meredith TC, Aggarwal P, Mamat U, Lindner B, Woodard RW. 2006. Redefining the Requisite Lipopolysaccharide Structure inEscherichia coli. ACS Chem. Biol.. 1(1):33-42. https://doi.org/10.1021/cb0500015

4. Samuel G, Reeves P. 2003. Biosynthesis of O-antigens: genes and pathways involved in nucleotide sugar precursor synthesis and O-antigen assembly. Carbohydrate Research. 338(23):2503-2519. https://doi.org/10.1016/j.carres.2003.07.009

5. JANN B, RESKE K, JANN K. 1975. Heterogeneity of Lipopolysaccharides. Analysis of Polysaccharide Chain Lengths by Sodium Dodecylsulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis. Eur J Biochem. 60(1):239-246. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1975.tb20996.x

6. Mayer H, Tharanathan R, Weckesser J. 1985. 6 Analysis of Lipopolysaccharides of Gram-Negative Bacteria.157-207. https://doi.org/10.1016/s0580-9517(08)70475-6

7. GALANOS C, LUDERITZ O, RIETSCHEL ET, WESTPHAL O, BRADE H, BRADE L, FREUDENBERG M, SCHADE U, IMOTO M, YOSHIMURA H, et al. 1985. Synthetic and natural Escherichia coli free lipid A express identical endotoxic activities. Eur J Biochem. 148(1):1-5. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1985.tb08798.x

8. Palsson-McDermott EM, O'Neill LAJ. 2004. Signal transduction by the lipopolysaccharide receptor, Toll-like receptor-4. Immunology. 113(2):153-162. https://doi.org/10.1111/j.1365-2567.2004.01976.x

9. Muroi M, Tanamoto K. 2002. The Polysaccharide Portion Plays an Indispensable Role in Salmonella Lipopolysaccharide-Induced Activation of NF-?B through Human Toll-Like Receptor 4. IAI. 70(11):6043-6047. https://doi.org/10.1128/iai.70.11.6043-6047.2002

10. Strain SM, Fesik SW, Armitage IM. 1983. Characterization of lipopolysaccharide from a heptoseless mutant of Escherichia coli by carbon 13 nuclear magnetic resonance.. Journal of Biological Chemistry. 258(5):2906-2910. https://doi.org/10.1016/s0021-9258(18)32804-7

11. Munford RS, Andersen JM, Dietschy JM. 1981. Sites of tissue binding and uptake in vivo of bacterial lipopolysaccharide-high density lipoprotein complexes: studies in the rat and squirrel monkey.. J. Clin. Invest.. 68(6):1503-1513. https://doi.org/10.1172/jci110404

12. Morrison DC, Rudbach JA. 1981. Endotoxin-Cell-Membrane Interactions Leading to Transmembrane Signaling.187-218. https://doi.org/10.1007/978-1-4684-3917-5_6

13. Galanos C. 1977. International Review of Biochemistry. Biochemistry of Lipids III Vol. 14, 2309. Baltimore, MD USA: University Park Press.

14. Kurtz HJ, Quast J. 1982. Effects of continuous intravenous infusion of Escherichia coli endotoxin into swine. 43(2). Am J Vet Res: 262-268.

15. Rick PD, Young DA. 1982. Isolation and characterization of a temperature-sensitive lethal mutant of Salmonella typhimurium that is conditionally defective in 3-deoxy-D-manno-octulosonate-8-phosphate synthesis.. 150(2):447-455. https://doi.org/10.1128/jb.150.2.447-455.1982

16. Skelly RR, Munkenbeck P, Morrison DC. 1979. Stimulation of T-independent antibody responses by hapten-lipopolysaccharides without repeating polymeric structure.. 23(2):287-293. https://doi.org/10.1128/iai.23.2.287-293.1979

17. Lang CH, Silvis C, Deshpande N, Nystrom G, Frost RA. 2003. Endotoxin Stimulates In Vivo Expression of Inflammatory Cytokines Tumor Necrosis Factor Alpha, Interleukin-1??, -6, and High-Mobility-Group Protein-1 in Skeletal Muscle. Shock. 19(6):538-546. https://doi.org/10.1097/01.shk.0000055237.25446.80

18. Müller-Loennies S, Brade L, MacKenzie C, Di Padova FE, Brade H. 2003. Identification of a Cross-reactive Epitope Widely Present in Lipopolysaccharide from Enterobacteria and Recognized by the Cross-protective Monoclonal Antibody WN1 222-5. Journal of Biological Chemistry. 278(28):25618-25627. https://doi.org/10.1074/jbc.m302904200

19. Staub A. Bacterial lipido-protinopolysaccharides ('O' somatic antigens) extraction with trichloroacetic acid in Methods in Carbohydrate Chem. Vol. 5, 92-93. Hoboken, NJ USA: John Wiley & Sons, Inc..

20. Westphal O, Jann K. 1965. Bacterial lipopolysaccharides extraction with phenolwater and further applications of the procedure in Methods in Carbohydrate Chem. Vol. 5, 92‑93. Hoboken, NJ USA: John Wiley & Sons, Inc.

21. Leive L, Morrison DC. 1972. [23] Isolation of lipopolysaccharides from bacteria.254-262. https://doi.org/10.1016/0076-6879(72)28025-9

22. Galanos C, Luderitz O, Westphal O. 1969. A New Method for the Extraction of R Lipopolysaccharides. Eur J Biochem. 9(2):245-249. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1969.tb00601.x