Lipopolisacharydy Informacje o produkcie

Synonim: LPS

Praca z lipopolisacharydami (LPS)

Lipopolisacharydy (LPS) są charakterystycznymi składnikami ściany komórkowej bakterii Gram ujemnych; nie występują u bakterii Gram dodatnich. Są one zlokalizowane w zewnętrznej warstwie błony i są, w szczepach niekapsułkowanych, eksponowane na powierzchni komórki. Przyczyniają się do integralności błony zewnętrznej i chronią komórkę przed działaniem soli żółciowych i lipofilowych antybiotyków.¹

Lipopolisacharydy składają się z hydrofobowego lipidu (lipid A, który jest odpowiedzialny za toksyczne właściwości cząsteczki), hydrofilowego łańcucha polisacharydowego rdzenia i hydrofilowego O-antygenowego łańcucha bocznego polisacharydu. W większości przypadków łańcuchy specyficzne dla O są zbudowane z powtarzających się jednostek oligosacharydów, które wykazują specyficzną dla szczepu różnorodność strukturalną. Składniki cukrowe, ich sekwencja i sposób wiązania determinują serologiczną swoistość O poszczególnych szczepów. Są one głównymi wyznacznikami klasyfikacji serotypów Salmonella gatunków. Różnorodność łańcuchów O w Enterobacteriaceae mogła rozwinąć się podczas ewolucji, aby umożliwić bakteriom jelitowym ucieczkę przed układem odpornościowym gospodarza poprzez opracowanie nowych specyficzności na ich powierzchni komórkowej (specyficznych dla serotypu bakterii).¹

Ponieważ lipopolisacharydy nadają komórce właściwości antygenowe, zostały one nazwane antygenami O. Jako główny antygen lipopolisacharydowy, lipopolisacharydy mają właściwości antygenowe. Jako główny antygen, lipopolisacharydy są zaangażowane w różne interakcje żywiciel-pasożyt. Wydaje się, że chronią one bakterie Gram ujemne przed fagocytozą i lizą.¹ Bakterie o wspólnych serotypach mają antygeny powierzchniowe (grupa O, grupa H lub LPS), które generują tę samą odpowiedź przeciwciał. Przykładami serotypów są O55:B5 i O26:B6 dla bakterii E. coli . Oznaczenia są klasyfikacjami immunologicznymi, które określają, które przeciwciało rozpoznaje które szczepy. Różne szczepy mogą mieć pewne wspólne determinanty antygenowe.

Jeśli dziki szczep bakterii zostanie napromieniowany światłem UV lub wystawiony na działanie związków mutagennych, ulegnie mutacji. Nieliczne mutacje, które nie są śmiertelne, prowadzą do powstania zdolnych do życia mutantów (szorstkich szczepów), które na ogół nie występują w naturze i które posiadają pewne unikalne cechy. Geny kodujące tworzenie lipopolisacharydów mogą być również zmienione w mutantach i mogą powstawać LPS o krótszych łańcuchach polisacharydowych. Ra, Rb, Rc, Rd, Re itd. (gdzie a, b, c itd... oznaczają odpowiednio 1, 2, 3 itd... stopień) oznaczają długość polisacharydu danego LPS. Ra i Re oznaczają mutanty o odpowiednio najdłuższych i najkrótszych długościach łańcuchów.² Najbardziej ekstremalnymi mutantami są mutanty Re, które wytwarzają LPS składający się z lipidu A i kwasu 3-deoksy-D-manno-oktulozonowego (2-keto-3-deoksyyoktonian, KDO) jako jedynego składnika rdzenia.²  Lipid A i lipopolisacharydy z szorstkich szczepów są testowane pod kątem zawartości KDO.³

Oczyszczona endotoksyna jest ogólnie określana jako lipopolisacharyd lub LPS, aby odróżnić ją od bardziej naturalnej złożonej formy związanej z błoną komórkową. Rdzeń łańcucha polisacharydowego jest wspólny dla LPS z dzikich i zmutowanych szczepów bakterii.

Usuwanie przez hydrolizę łańcucha polisacharydowego z LPS wytwarza lipid A, albo jako naturalnie występującą, cytotoksyczną formę difosforylową⁴ lub mniej toksyczną formę monofosforylową.^5,6 Im dłuższy łańcuch polisacharydowy, tym dłuższa i trudniejsza hydroliza. LPS z długim łańcuchem polisacharydowym ma stosunkowo niską zawartość lipidu A, który musi być oczyszczony z dużej ilości produktów ubocznych hydrolizy (oligosacharydów i monomerów sacharydowych). W związku z tym wydajność lipidu A jest niska, a odzysk słaby. LPS z krótkim łańcuchem polisacharydowym (LPS ze zmutowanych bakterii) jest zatem wykorzystywany do wytwarzania produktów lipidowych A. Usunięcie części kwasu tłuszczowego z lipidu A skutkuje detoksykacją LPS⁷ z poziomem endotoksyny około 10 000 razy niższym niż w przypadku macierzystego LPS.

Badano strukturę molekularną LPS.^8,9 Ponieważ LPS jest heterogeniczny i ma tendencję do tworzenia agregatów o różnych rozmiarach, masa cząsteczkowa nie jest zbyt znacząca. Jednakże odnotowano zakres 1-4 milionów lub większy. Gdy LPS jest poddawany działaniu SDS i ciepła, masa cząsteczkowa mieści się w zakresie od 50 do 100 kDa. W najczystszej postaci, w obecności silnych środków powierzchniowo czynnych i przy braku kationów dwuwartościowych, endotoksyny bakteryjne składają się z makrocząsteczek o masie 10-20 kDa. Uważa się, że przy braku środków powierzchniowo czynnych i w obecności dwuwartościowych kationów sekwestrujących, takich jak EDTA, LPS układa się w strukturę micelarną o masie cząsteczkowej około 1000 kDa. Jest to najmniejsza forma bakteryjnego LPS, która może istnieć w cieczach wodnych. W obecności kationów dwuwartościowych, takich jak Ca²⁺ i Mg²⁺, wydaje się istnieć struktura dwuwarstwowa, która przechodzi przez błonę 0,2 μm, ale nie przechodzi przez błonę 0,025 μm. Pęcherzyki LPS o średnicy do 0,1 μm mogą również powstawać w wodzie w obecności kationów dwuwartościowych. Samoczynna agregacja LPS jest generalnie funkcją lipidowego składnika A cząsteczki, który również nadaje zdolność wiązania się z powierzchniami hydrofobowymi.

LPS można przygotować przez ekstrakcję TCA,¹⁰ fenolem,¹¹ lub fenolchloroformem-eterem naftowym (dla szczepów szorstkich)¹² . Lipopolisacharydy ekstrahowane TCA są strukturalnie podobne do tych ekstrahowanych fenolem. Ich wzór elektroforetyczny i endotoksyczność są podobne. Główne różnice dotyczą ilości zanieczyszczeń kwasami nukleinowymi i białkami. Ekstrakt TCA zawiera około 2% RNA i około 10% zdenaturowanych białek. Ekstrakt fenolowy zawiera do 60% RNA i mniej niż 1% białka. Oczyszczanie za pomocą chromatografii z filtracją żelową usuwa znaczną część białka obecnego w LPS ekstrahowanym fenolem, ale pozostawia produkt, który nadal zawiera 10-20% kwasów nukleinowych. Dalsze oczyszczanie przy użyciu chromatografii jonowymiennej daje produkt LPS, który zawiera <1% białka i <1% RNA. Oferujemy LPS z różnymi poziomami białka i/lub RNA.

Nasze lipopolisacharydy zawierają poziom endotoksyny nie mniejszy niż 500 000 EU (jednostek endotoksyny)/mg, chyba że zaznaczono inaczej. Jeden nanogram endotoksyny odpowiada  0,5 EU w 1 ng materiału, jeśli masz 500 000 EU/mg (test lizatu Limulus) i 10 EU (test chromogenny).

Preparaty LPS są szeroko stosowane w badaniach nad strukturą LPS,¹³ metabolizmem,¹⁴ immunologii,¹⁵ fizjologii,¹⁶ toksyczności,¹⁷ i biosyntezy.¹⁸  Zostały one również wykorzystane do indukowania syntezy i wydzielania czynników promujących wzrost, takich jak interleukiny.¹⁹

Koniugaty FITC (izotiocyjanian fluoresceiny), TRITC (izotiocyjanian tetrametylodaminy) i TNP (trinitrofenyl) zostały przygotowane poprzez reakcję LPS odpowiednio z FITC, TRITC lub kwasem 2,4,6-trinitrobenzenosulfonowym.²⁰ Są one wykorzystywane w badaniach nad niezależną od limfocytów T odpowiedzią immunologiczną komórek B na bakteryjny LPS.²⁰

Środki ostrożności i wyłączenie odpowiedzialności

Wyłącznie do użytku laboratoryjnego.

Przechowywanie/stabilność

Roztwory o stężeniu 1 mg/ml w buforze lub pożywce hodowlanej są stabilne przez około miesiąc w temperaturze 2-8°C. Zamrożone podwielokrotności mogą być przechowywane do 2 lat. Powtarzane cykle zamrażania/rozmrażania nie są zalecane. Roztwory powinny być przechowywane w silanizowanych pojemnikach, ponieważ LPS może wiązać się z tworzywami sztucznymi i niektórymi rodzajami szkła (szczególnie w stężeniach 0,1 mg/ml). Jeśli stężenie LPS wynosi 1 mg/ml, adsorpcja na ściankach fiolki jest znikoma. Jeśli używane są szklane pojemniki, roztwory należy worteksować przez co najmniej 30 minut w celu ponownego rozpuszczenia zaadsorbowanego produktu.

Instrukcje przygotowania

Produkt jest rozpuszczalny w wodzie (5 mg/ml) lub pożywce do hodowli komórkowych (1 mg/ml), dając mętny, słabo żółty roztwór. Bardziej stężony, choć nadal mętny roztwór (20 mg/ml) uzyskano w wodnym roztworze soli fizjologicznej po worteksowaniu i ogrzaniu do
70-80 °C.²¹ Lipopolisacharydy są cząsteczkami, które tworzą micele w każdym rozpuszczalniku. Mętne roztwory obserwuje się w wodzie i soli fizjologicznej buforowanej fosforanami. Organiczne rozpuszczalniki nie dają bardziej klarownych roztworów. Metanol daje mętną zawiesinę z substancjami pływającymi, podczas gdy woda daje jednorodnie zamglony roztwór.

Do użytku w hodowli komórkowej, LPS należy odtworzyć dodając 1 ml sterylnego zbilansowanego roztworu soli lub pożywki do hodowli komórkowej do fiolki (1 mg) i delikatnie mieszając, aż proszek się rozpuści. Roztwory można dalej rozcieńczać do pożądanego stężenia roboczego za pomocą dodatkowych sterylnych zrównoważonych roztworów soli lub pożywek do hodowli komórkowych.

Tabela LPS

Źródło Organizm	Metoda ekstrakcjiMetoda ekstrakcji	Filtracja żelowa	Filtracja żelowa γ-irr.	Wymiana jonowa	Detoksykowane	Filtracja żelowa FITC Label	Filtracja żelowa TNP Label
O26:B6 E. coli	Fenol - L8274 TCA - L8274 TCA - L8274 .L3755	L2762	L2654
O55:B5 E. coli	Phenol - .L2880 TCA - L4005	L2637	L6529	L4524	L9023	F8666
O111:B4 E. coli	L2637	L3012	.L4391	L3024	L3023	F3665	T3382
O127:B8 E. coli	Phenol - L3129 TCA - L3880	L3137	L4516	L5024
O128:B12 E. coli	Phenol - L2755	L2887					T6769
E. coli EH-100 (mutant Ra)	Ph/Chl/Pet - L9641
E. coli F-583 (mutant Rd)	Ph/Chl/Pet - L6893	.
E. coli J5 (mutant Rc)	Ph/Chl/Pet - L5014
E. coli K-235	Phenol - L2143	L2018
Klebsiella pneumoniae	Phenol - L4268
Pseudomonas aeroginosa 10	Phenol - L9143 TCA - L7018	L8643
Salmonella abortus equi	Phenol - L5886 TCA - L6636	L1887
Salmonella enteritidis	Phenol - L6011	L2012	.L7770	L4774
Salmonella minnesota	Phenol - L6261 TCA - L7011	L2137	L4641
Salmonella minnesota szczep Re595 (mutant Re)	Ph/Chl/Pet - L9764
Salmonella typhimurium	Fenol - L6511 TCA - L7261	L2262	L6143
Salmonella typhimurium szczep SL1181 (mutant Re)	Ph/Chl/Pet - L9516
Salmonella typhimurium szczep TV119 (mutant Ra)	Ph/Chl/Pet - L6016
Salmonella typhosa	Fenol - L6386 TCA - L7136	L2387	L7895
Serratia marcescens	Phenol - L6136

* = numer produktu wycofanego
Ph/Chl/Pet = fenol:chloroform:eter naftowy

Referencje

1. Mayer H, Tharanathan R, Weckesser J. 1985. 6 Analysis of Lipopolysaccharides of Gram-Negative Bacteria.157-207. https://doi.org/10.1016/s0580-9517(08)70475-6

2. Raetz CRH. 1990. Biochemistry of Endotoxins. Annu. Rev. Biochem.. 59(1):129-170. https://doi.org/10.1146/annurev.bi.59.070190.001021

3. CYNKIN MA, ASHWELL G. 1960. Estimation of 3-Deoxy Sugars by Means of the Malonaldehyde?Thiobarbituric Acid Reaction. Nature. 186(4719):155-156. https://doi.org/10.1038/186155a0

4. Qureshi N, Takayama K, Heller D, Fenselau C. 1983. Position of ester groups in the lipid A backbone of lipopolysaccharides obtained from Salmonella typhimurium. J Biol Chem. 258(21):12947-51.

5. Chang C, Nowotny A. 1975. Relation of structure to function in bacterial O-antigens?VII. Endotoxicity of ?lipid A?. Immunochemistry. 12(1):19-28. https://doi.org/10.1016/0019-2791(75)90045-2

6. Qureshi N, Takayama K, Ribi E. 1982. Purification and structural determination of nontoxic lipid A obtained from the lipopolysaccharide of Salmonella typhimurium. J Biol Chem. 257(19):11808-15.

7. Ding HF, Nakoneczna I, Hsu HS. 1990. Protective immunity induced in mice by detoxified salmonella lipopolysaccharide. Journal of Medical Microbiology. 31(2):95-102. https://doi.org/10.1099/00222615-31-2-95

8. JANN B, RESKE K, JANN K. 1975. Heterogeneity of Lipopolysaccharides. Analysis of Polysaccharide Chain Lengths by Sodium Dodecylsulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis. Eur J Biochem. 60(1):239-246. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1975.tb20996.x

9. Leive L, Morrison DC. 1972. [23] Isolation of lipopolysaccharides from bacteria.254-262. https://doi.org/10.1016/0076-6879(72)28025-9

10. Staub A. 1965. Bacterial Lipido-protinopolysaccharides (‘O’ Somatic Antigens) Extraction with Trichloroacetic Acid. Methods in Carbohydrate Chem. 592-93.

11. Westphal O, Jann K. 1965. Bacterial Lipopolysaccharides Extraction with Phenol-Water and Further Applications of the Procedure. Methods in Carbohydrate Chem. 583-91.

12. Galanos C, Luderitz O, Westphal O. 1969. A New Method for the Extraction of R Lipopolysaccharides. Eur J Biochem. 9(2):245-249. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1969.tb00601.x

13. Strain S, Fesik S, Armitage I. 1983. Characterization of lipopolysaccharide from a heptoseless mutant of Escherichia coli by carbon 13 nuclear magnetic resonance. J Biol Chem. 258(2):2906-10.

14. Munford RS, Andersen JM, Dietschy JM. 1981. Sites of tissue binding and uptake in vivo of bacterial lipopolysaccharide-high density lipoprotein complexes: studies in the rat and squirrel monkey.. J. Clin. Invest.. 68(6):1503-1513. https://doi.org/10.1172/jci110404

15. Morrison DC, Rudbach JA. 1981. Endotoxin-Cell-Membrane Interactions Leading to Transmembrane Signaling.187-218. https://doi.org/10.1007/978-1-4684-3917-5_6

16. Goodwin T. 1977. Biochemistry of Lipids II. Baltimore: Univeristy Park Press.

17. Kurtz H, Quast J. 1982. Effects of continuous intravenous infusion of Escherichia coli endotoxin into swine. Am J Vet Res. 43(2):262-8.

18. Rick PD, Young DA. 1982. Isolation and characterization of a temperature-sensitive lethal mutant of Salmonella typhimurium that is conditionally defective in 3-deoxy-D-manno-octulosonate-8-phosphate synthesis.. 150(2):447-455. https://doi.org/10.1128/jb.150.2.447-455.1982

19. Oppenheim JJ, Kovacs EJ, Matsushima K, Durum SK. 1986. There is more than one interleukin 1. Immunology Today. 7(2):45-56. https://doi.org/10.1016/0167-5699(86)90124-6

20. Skelly RR, Munkenbeck P, Morrison DC. 1979. Stimulation of T-independent antibody responses by hapten-lipopolysaccharides without repeating polymeric structure.. 23(2):287-293. https://doi.org/10.1128/iai.23.2.287-293.1979

21. Customer Report.

22. Fomsgaard A, Freudenberg MA, Bendtzen K, Galanos C. 1990. Quantitation and biological activities of native tumour necrosis factor from LPS-stimulated human monocytes. 98(1-6):529-534. https://doi.org/10.1111/j.1699-0463.1990.tb01067.x

23. Bleicher P, Rollins-Smith LA, Jacobs DM, Cohen N. 1983. Mitogenic responses of frog lymphocytes to crude and purified preparations of bacterial lipopolysaccharide (LPS). Developmental & Comparative Immunology. 7(3):483-496. https://doi.org/10.1016/0145-305x(83)90033-2

24. Sveen K, Skaug N. 1992. Comparative mitogenicity and polyclonal B cell activation capacity of eight oral or nonoral bacterial lipopolysaccharides in cultures of spleen cells from athymic (nu/nu-BALB/c) and thymic (BALB/c) mice. Oral Microbiol Immunol. 7(2):71-77. https://doi.org/10.1111/j.1399-302x.1992.tb00512.x

25. Hepper K, Garman RD, Lyons MF, Teresa GW. 1979. Plaque-forming cell response in BALB/c mice to two preparations of LPS extracted from Salmonella enteritidis. J Immunol. 122(4):1290-3.

26. Gardiner JS, Keil LB, DeBari VA. 1991. In vitro Formation of Complement Activation Products by Lipopolysaccharide Chemotypes of Salmonellaminnesota. Int Arch Allergy Immunol. 96(1):51-54. https://doi.org/10.1159/000235534

27. Salter M, Knowles RG, Moncada S. 1991. Widespread tissue distribution, species distribution and changes in activity of Ca2+-dependent and Ca2+-independent nitric oxide synthases. 291(1):145-149. https://doi.org/10.1016/0014-5793(91)81123-p

28. Mond JJ, Brunswick M. 2003. Proliferative Assays for B Cell Function. Current Protocols in Immunology. 57(1): https://doi.org/10.1002/0471142735.im0310s57

29. Geller DA, Lowenstein CJ, Shapiro RA, Nussler AK, Di Silvio M, Wang SC, Nakayama DK, Simmons RL, Snyder SH, Billiar TR. 1993. Molecular cloning and expression of inducible nitric oxide synthase from human hepatocytes.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90(8):3491-3495. https://doi.org/10.1073/pnas.90.8.3491

30. Wrenger E, Baumann C, Behrend M, Zamore E, Schindler R, Brunkhorst R. 1998. Peritoneal mononuclear cell differentiation and cytokine production in intermittent and continuous automated peritoneal dialysis. American Journal of Kidney Diseases. 31(2):234-241. https://doi.org/10.1053/ajkd.1998.v31.pm9469493

31. Hawkins D, MacKay R, MacKay S, Moldawer L. 1998. Human interleukin 10 suppresses production of inflammatory mediators by LPS-stimulated equine peritoneal macrophages. Veterinary Immunology and Immunopathology. 66(1):1-10. https://doi.org/10.1016/s0165-2427(98)00181-0

32. Xu H, Gonzalo JA, St Pierre Y, Williams IR, Kupper TS, Cotran RS, Springer TA, Gutierrez-Ramos JC. 1994. Leukocytosis and resistance to septic shock in intercellular adhesion molecule 1-deficient mice.. 180(1):95-109. https://doi.org/10.1084/jem.180.1.95

33. Stuehr DJ, Marletta MA. 1985. Mammalian nitrate biosynthesis: mouse macrophages produce nitrite and nitrate in response to Escherichia coli lipopolysaccharide.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 82(22):7738-7742. https://doi.org/10.1073/pnas.82.22.7738

34. Wang J, Kester M, Dunn MJ. 1988. The effects of endotoxin on platelet-activating factor synthesis in cultured rat glomerular mesangial cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 969(3):217-224. https://doi.org/10.1016/0167-4889(88)90055-9

35. Cassatella MA, Bazzoni F, Flynn RM, Dusi S, Trinchieri G, Rossi F. 1990. Molecular basis of interferon-gamma and lipopolysaccharide enhancement of phagocyte respiratory burst capability. Studies on the gene expression of several NADPH oxidase components. J Biol Chem. 265(33):20241-6.