Deglikozylacja glikoprotein

Powiązane z paraginą (N-linked) i seryną/treoniną (O-linked) oligosacharydy są głównymi składnikami strukturalnymi wielu białek eukariotycznych. Pełnią one krytyczne funkcje biologiczne w sortowaniu białek, rozpoznawaniu immunologicznym, wiązaniu receptorów, stanach zapalnych, patogenności i wielu innych procesach. Różnorodność struktur oligosacharydów, zarówno O- jak i N-związanych, często skutkuje niejednorodnością masy i ładunku glikoprotein. Różnice w strukturze i różne stopnie nasycenia miejsc glikozylacji w glikoproteinie przyczyniają się do niejednorodności masy. Obecność kwasu sialowego (kwasu N-acetylo-neuraminowego) również wpływa zarówno na masę, jak i ładunek glikoproteiny. N-połączone oligosacharydy mogą wnosić 3,5 kDa lub więcej na strukturę do masy glikoproteiny (Rysunek 1). Cukry O-związane, choć zwykle mniej masywne niż struktury N-związane, mogą być liczniejsze (Rysunki 2 i 3).

Rysunek 1. Tetraantennary N-linked Sugar.

Rysunek 2. Di- i trisialyated O-linked Core-1 Saccharides (rdzeń pogrubiony).

Rysunek 3. O-związany heksasacharyd Core-2.

Skróty:
Gal - Galaktoza, Man - Mannoza, GalNAc - N-acetylogalaktozamina, GlcNAc - N-acetyloglukozamina, NeuAc - m.in. Kwas N-acetyloneuraminowy (kwas sialowy)

Aby zbadać strukturę i funkcję glikoproteiny, często pożądane jest usunięcie wszystkich lub wybranej klasy oligosacharydów. Pozwala to na przypisanie określonych funkcji biologicznych do poszczególnych składników glikoproteiny. Na przykład utrata wiązania ligandu z glikoproteiną po usunięciu kwasu sialowego może wskazywać na ten cukier w procesie wiązania.

Usunięcie grup węglowodanowych z glikoprotein jest wysoce zalecane do identyfikacji białek. Glikoproteiny i glikopeptydy słabo jonizują podczas analizy spektrometrii mas (MS), co prowadzi do nieadekwatnych danych spektralnych. Glikopeptydy mają niższą czułość wykrywania ze względu na mikroheterogeniczność przyłączonych glikanów, co powoduje tłumienie sygnału. Proteolityczne (tryptyczne) trawienie natywnych glikoprotein jest często niekompletne z powodu przeszkód sterycznych wynikających z obecności dużych oligosacharydów. Rozszczepienie proteolityczne jest jednak warunkiem wstępnym podczas elucji fragmentów peptydów z żeli w celu identyfikacji za pomocą MS. Deglikozylacja glikopeptydów przed trawieniem tryptycznym zwiększa pokrycie sekwencji białka i poprawia jego identyfikację, a także pomaga w identyfikacji miejsc glikozylacji na rdzeniu białka.

Zestawy do chemicznej i enzymatycznej deglikozylacji glikopeptydów

• Chemiczna deglikozylacja przy użyciu hydrolizy kwasu trifluorometanosulfonowego (TFMS) pozostawia nienaruszony składnik białkowy, ale niszczy glikany. Glikoproteiny pochodzące od zwierząt, roślin, grzybów i bakterii były deglikozylowane za pomocą tej procedury. Doniesiono, że biologiczne, immunologiczne i wiążące receptory właściwości niektórych glikoprotein są zachowane po deglikozylacji za pomocą tej procedury, chociaż może to nie być prawdą dla wszystkich glikoprotein. Reakcja jest niespecyficzna, usuwając wszystkie typy glikanów niezależnie od struktury, chociaż do całkowitego usunięcia glikanów O-linkowych wymagana jest przedłużona inkubacja. Ponadto najbardziej wewnętrzna reszta GlcNAc związana z Asn w glikanach związanych z N pozostaje przyłączona do białka. Metoda ta usuwa N-glikany z glikoprotein roślinnych, które są zwykle odporne na hydrolizę enzymatyczną.

• Deglikozylacja enzymatyczna jest zalecana do stosowania z N-połączonymi glikanami i może być połączona z trawieniem tryptycznym. Zastosowanie enzymu glikolitycznego PNGazy F jest najskuteczniejszą metodą usuwania praktycznie wszystkich N-połączonych oligosacharydów z glikoprotein. Peptydo-N-glikozydaza F (PNGaza F) uwalnia oligosacharydy związane z asparaginą z glikoprotein i glikopeptydów poprzez hydrolizę grupy amidowej łańcucha bocznego asparaginy (Asn). Tripeptyd z asparaginą związaną z oligosacharydem jako centralną resztą jest minimalnym substratem dla PNGazy F. Oligosacharydy mogą być wysokomannozowe, hybrydowe lub złożone. Jednakże N-glikany z fukozą połączoną α(1→3) z N-acetyloglukozaminą związaną z asparaginą są odporne na działanie PNGazy F (Rysunek 4).

Rysunek 4. Wymagania dotyczące miejsca rozszczepienia dla PNGazy F. R1 = podstawienie N- i C- przez grupy inne niż H, R2 = H lub reszta oligosacharydu, R3 = H lub α(1→6) fukoza.

Zestaw do chemicznej deglikozylacji GlycoProfile™ IV

Zoptymalizowany zestaw do chemicznej deglikozylacji GlycoProfile IV usuwa glikany z glikoprotein przy użyciu kwasu trifluorometanosulfonowego (TFMS). Zdeglikozylowane białko może być następnie odzyskane przy użyciu odpowiedniej metody przetwarzania, takiej jak filtracja żelowa lub dializa. W przeciwieństwie do innych chemicznych metod de glikozylacji, hydroliza z bezwodnym TFMS jest bardzo skuteczna w usuwaniu glikanów O- i N-związanych (z wyjątkiem najbardziej wewnętrznego GlcNAc związanego z Asn glikanów N-związanych) przy minimalnej degradacji białka. Stopień deglikozylacji można ocenić na podstawie przesunięcia ruchliwości zdeglikozylowanego białka w stosunku do nienaruszonej glikoproteiny na żelach SDS-PAGE (Rys. 5).

Rysunek 5. Analiza chemicznej deglikozylacji RNazy B na 12% jednorodnym żelu SDS-PAGE. Pas 1 to kontrola RNazy B (nr produktu R1153), podczas gdy pasy od 2 do 5 reprezentują frakcje zebrane z kolumny filtracji żelowej. Pasy 2 i 3 to frakcje o objętości wstępnej, a pasy 4 i 5 pokazują pasma o masie 13,5 kDa, odpowiadające zdeglikozylowanej RNazie B.

• Każda reakcja przetwarza 1-2 mg glikoproteiny - Wystarczająca ilość danych wyjściowych do dalszej analizy
• Minimalna degradacja rdzenia białka - Dla wiarygodnych danych MS
• Kompletna deglikozylacja w ciągu krótkiego czasu - Dla zwiększenia wydajności
• Dla zwiększenia wydajności Dla bardziej wiarygodnych danych MS
• Całkowita deglikozylacja w zaledwie 30 minut -  Dla zwiększonej przepustowości

Zestaw do enzymatycznej deglikozylacji białek

Zestaw do enzymatycznej deglikozylacji białek zawiera wszystkie enzymy i odczynniki potrzebne do całkowitego usunięcia wszystkich N- i prostych O-związanych węglowodanów z glikoprotein oraz rozszczepienia złożonych węglowodanów związanych z rdzeniem 2 O, w tym zawierających polilaktozaminę.

PNGaza F (peptyd-N-glikozydaza F) jest dołączona do N-związanej deglikozylacji glikoprotein i glikopeptydów w roztworze, w trawieniu żelowym lub na membranach blot. Enzym uwalnia oligosacharydy związane z asparaginą z glikoprotein i glikopeptydów poprzez hydrolizę grupy amidowej łańcucha bocznego asparaginy (Asn).

Do degradacji glikanów związanych z O, monosacharydy muszą być usunięte przez serię egzoglikozydaz, aż tylko rdzeń Gal- β(1→3)-GalNAc pozostanie przyłączony do seryny/treoniny. Zestaw EDEGLY zawiera α(2→3,6,8,9)-neuraminidazę (sialidazę A) do rozszczepiania końcowych reszt kwasu sialowego oraz O-glikozydazę do usuwania rdzenia Gal-β(1→3)-GalNAc. β(1→4)-Galaktozydaza i β-N-Acetyl glukozo aminidaza są również dostarczane w celu usunięcia cukrów związanych ze specyficznymi strukturami glikanu O-linked.

• Deglikozyluje do dwóch mg glikoproteiny - Wystarczające do dalszego przetwarzania
• Pojedyncza reakcja przy neutralnym pH - Zachowuje oryginalną strukturę peptydu
• Bez degradacji białek - Przeprowadza analizę struktury peptydów
• Usuwa cukry O-linkowe zawierające kwas polisialowy - Uzyskuje dokładniejszą analizę peptydów
• Dostarczona glikoproteina kontrolna - Weryfikacja zwiększa pewność i spójność

GlycoProfile™ I Enzymatic In-Gel N-Deglycosylation Kit

Zestaw GlycoProfile I Enzymatic In-Gel N-Deglycosylation Kit solidnie usuwa N-wiązane glikany i trawi próbki białek z żeli poliakrylamidowych 1D lub 2D do analizy MS lub HPLC. Zestaw działa dobrze dla Coomassie Brilliant Blue, koloidalnej Coomassie i żeli barwionych srebrem, gdy jest odpowiednio odbarwiony. Enzym glikolityczny PNGase F (Peptide-N-glycosidase F) działa doskonale, gdy jest stosowany do de glikozylacji glikoprotein i glikopeptydów w żelu. Trypsyna Proteomics Grade skutecznie trawi pozostałe białko. Odsolone próbki są następnie zatężane do analizy metodą MALDI-TOF-MS lub ES-MS (Rysunek 6).

Rysunek 6. Proces dla zestawu GlycoProfile I Enzymatic In-Gel N-Deglycosylation Kit. Deglikozylacja glikoprotein

• Deglikozylacja i trawienie w żelu - Minimalizuje manipulację próbką
• Wysoko oczyszczone enzymy - Zapobiega niepożądanym działaniom i produktom ubocznym
• Niska zawartość soli buforowej - Oszczędza czas i czas analizyli>Niska zawartość soli buforowej - Eliminuje zakłócenia w analizie MS
• Dołączony odczynnik dezynfekujący - Oszczędza czas poprzez redukcję dodatkowego przygotowania odczynnika