Najczęściej zadawane pytania dotyczące hodowli komórkowych: Zanieczyszczenie endotoksyną bakteryjną

Co to jest endotoksyna?

Endotoksyny to małe cząsteczki hydrofobowego lipopolisacharydu (LPS) pochodzenia bakteryjnego, które mogą łatwo zanieczyścić sprzęt laboratoryjny i których obecność może znacząco wpływać zarówno na eksperymenty in vitro jak i in vivo . Ich obecność jest wykrywana przez lizat amebocytów limfatycznych (test LAL), który może wykryć do 0,01 jednostki endotoksyny (EU) / ml. Endotoksyny mają wielkość około 10 kDa, ale łatwo tworzą duże agregaty do 1000 kDa. Bakterie wydzielają endotoksyny w dużych ilościach po śmierci komórki oraz gdy aktywnie rosną i dzielą się. Pojedyncza bakteria Escherichia coli zawiera około 2 milionów cząsteczek LPS na komórkę. Endotoksyny mają wysoką stabilność termiczną, co uniemożliwia ich zniszczenie w normalnych warunkach sterylizacji. Są to cząsteczki amfipatyczne, które w roztworze mają ładunek ujemny netto. Ze względu na ich hydrofobowość, prawdopodobnie mają silne powinowactwo do innych hydrofobowych materiałów, takich jak produkty z tworzyw sztucznych używane w laboratorium. Z tego powodu zanieczyszczenia pochodzące ze zlewek laboratoryjnych, prętów mieszających i innego sprzętu laboratoryjnego są powszechne.

Figure 1. Structure and physical properties of bacterial endotoxin. Endotoxins are complex lipopolysaccharides (LPS) present in the outer cell membrane of gram-negative bacteria. Endotoxins consist of a core polysaccharide chain, O-specific polysaccharide side chains (O-antigen) and a lipid component, Lipid A, which is responsible for the toxic effects.

Jaka jest różnica między endotoksyną a egzotoksyną?

Oba są potencjalnie niebezpieczne dla kultur komórkowych. Egzotoksyny to toksyczne substancje, zwykle białka, wydzielane przez bakterie i uwalniane na zewnątrz komórki. Natomiast endotoksyny to toksyny bakteryjne składające się z lipidów, które znajdują się w ścianie komórkowej bakterii. Egzotoksyny są zwykle niszczone pod wpływem ciepła, podczas gdy endotoksyny nie mogą zostać zniszczone przez wysoką temperaturę. Egzotoksyny mają wysoką antygenowość i wywołują odpowiedź immunologiczną, podczas gdy endotoksyny nie.

Jak badana jest endotoksyna?

Test lizatu amebocytów limfatycznych (test LAL) jest najczęściej stosowanym testem na obecność endotoksyny. LAL (pochodzący od kraba podkowiastego) reaguje z endotoksyną bakteryjną lipopolisacharydem (LPS), który jest składnikiem błony bakterii Gram-ujemnych, tworząc żel-skrzep, który można określić ilościowo. Endotoksyna jest mierzona w jednostkach endotoksyny na mililitr (EU/mL). Jedna jednostka EU odpowiada w przybliżeniu 0,1 do 0,2 ng endotoksyny/mL roztworu. Obecnie istnieją trzy formy testu LAL, każda o różnej czułości. Test skrzepu żelowego LAL może wykrywać do 0,03 EU / ml, podczas gdy testy kinetyczne turbidymetryczne i chromogenne LAL mogą wykrywać do 0,01 EU / ml.

Figure 2. LAL assay test principle. The cascade of endotoxin detection in Limulus amoebocyte lysate (LAL) assay starts when the endotoxin LPS reacts with Factor C in and turn, activates the factor B. Factor B turns the gel-forming pro-enzyme into an enzyme. The resulting clotting enzyme is responsible for anchoring the two peptide units in the coagulogen, forming an insoluble gel. Other compounds which also cause the gelation in the amebocyte lysate of the horseshoe crab can interference in the test of bacterial endotoxins. Some of these compounds are (1,3)-β-D-glucans, which lead to false positives in the LAL test.

Jakie są typowe źródła zanieczyszczenia endotoksynami w laboratorium?

Dokładna czystość wszystkich naczyń laboratoryjnych, surowców do produkcji pożywek i odpowiednie techniki laboratoryjne są niezbędne do znacznego obniżenia poziomu endotoksyn w laboratorium hodowli komórkowej. Zaleca się również sterylizację wszystkich pożywek za pomocą urządzenia filtrującego, takiego jak Stericup^® jednostka filtrująca, która może wyeliminować wszystkie potencjalne endotoksyny przed wprowadzeniem do komórek.

• Woda: Woda o wysokiej czystości jest niezbędna w każdym laboratorium. Milli-Q^® Integral to system oczyszczania wody zapewniający laboratoriom ultraczystą wodę wolną od endotoksyn, bezpośrednio z wody wodociągowej. System jest w stanie wyprodukować do 300 l czystej i/lub ultraczystej wody dziennie, zaspokajając potrzeby większości laboratoriów. Ponadto oferujemy jednorazowe butelki z wodą wolną od endotoksyn do wszystkich zastosowań w hodowli komórkowej.
• Serum: Ze względu na biologiczne źródło pochodzenia zwierzęcego, płodowa surowica bydlęca była w przeszłości głównym winowajcą zawierającym endotoksyny. Jednak ulepszone badania przesiewowe znacznie zmniejszyły ryzyko. Każda partia naszej surowicy została przetestowana pod kątem poziomu endotoksyn, aby zapewnić wysoki poziom wydajności.
• Odczynniki do hodowli komórkowych: Powszechnie stosowane odczynniki, takie jak Ecoli. rekombinowane czynniki wzrostu, hormony, lipidy, pożywki podstawowe i odczynniki dysocjacyjne, takie jak trypsyna, mogą być źródłem endotoksyn. Testujemy wszystkie nasze odczynniki do hodowli komórkowych pod kątem poziomu endotoksyn.
• Naczynia plastikowe/szklane: Naczynia szklane, plastikowe rurki i złączki powinny być wolne od pirogenów, a naczynia wielokrotnego użytku powinny być płukane wodą wolną od pirogenów lub o niskiej zawartości endotoksyn. Plastikowe butelki powinny być sterylizowane za pomocą promieniowania gamma.
• Skażenie użytkownika: Bakterie są obecne na wszystkich powierzchniach skóry, włosów i śliny. Dlatego też, aby zminimalizować ryzyko wprowadzenia endotoksyny do systemu, konieczna jest odpowiednia technika aseptyczna podczas pracy z kulturami komórkowymi.

Jaki jest wpływ endotoksyny na kultury komórkowe?

Endotoksyny wpływają zarówno na in vitro jak i in vivo wzrost i funkcjonowanie komórek i są źródłem znacznej zmienności.In vitro, istnieje coraz więcej dowodów na to, że endotoksyna powoduje szereg problemów w badaniach nad kulturami komórkowymi. Wśród udokumentowanych skutków była stymulacja hodowli leukocytów do produkcji czynników tkankowych, indukowana produkcja IL-6 w makrofagach końskich oraz hamowanie tworzenia kolonii erytroidalnych u myszy przez bardzo niskie poziomy (poniżej 1 ng/ml) endotoksyny. In vivo, endotoksyny wywołują odpowiedź zapalną w badaniach na zwierzętach. Obecność endotoksyny w produktach do wstrzykiwań (szczepionkach i lekach do wstrzykiwań) może powodować reakcje pirogenne, od gorączki i dreszczy po nieodwracalny i śmiertelny wstrząs septyczny.

Jakie są dopuszczalne limity endotoksyny w hodowlach komórkowych?

Z uwagi na poważne ryzyko związane z zanieczyszczeniem endotoksyną, Amerykańska Agencja ds. Żywności i Leków (FDA) ustaliła limity stężenia endotoksyny dla urządzeń medycznych i leków pozajelitowych, o których badacze powinni wiedzieć. Obecne limity FDA wymagają, aby eluaty z urządzeń medycznych były mniejsze niż 0,5 EU / ml, chyba że urządzenie wchodzi w kontakt z płynem mózgowo-rdzeniowym, gdzie limit wynosi wówczas 0,06 EU / ml.

Jak zapobiegać zanieczyszczeniu endotoksynami?

Niezbędne jest stosowanie odczynników, suplementów i pożywek przetestowanych pod kątem obecności endotoksyn od zaufanego dostawcy odczynników. Ważne jest również stosowanie odpowiednich technik aseptycznych oraz dokładne płukanie i sterylizacja wszystkich plastikowych naczyń do hodowli komórkowych i materiałów eksploatacyjnych, takich jak pipety i probówki stożkowe przed hodowlą komórek.

Jak usunąć endotoksynę w przypadku zanieczyszczenia hodowli?

Zaleca się odrzucenie wszystkich odczynników i komórek, jeśli hodowle zostaną zanieczyszczone endotoksyną i rozpoczęcie hodowli od nowych odczynników i komórek. Jeśli jednak próbki nie można wyrzucić, można użyć odczynników w celu ich wyeliminowania. Te roztwory do usuwania endotoksyn opierają się na właściwościach micelarnych Triton X-114 w celu usunięcia endotoksyn LPS z próbek.