Oznaczanie enancjomerów kwasu L- i D-mlekowego metodą HPLC/MS/MS

H. Henry¹, N. Marmy Conus², P. Steenhout², A. Benguin¹, O. Boulat¹

¹University of Lausanne, ²Nestac Ltd.

Wprowadzenie

Niniejszy artykuł stanowi podsumowanie pracy H. Henry'ego i współpracowników z Clinical Chemistry Laboratory, Centre Hospitalier Universiaire Vaudois, University of Lausanne, CH-1011 Lausanne, Szwajcaria¹. Oznaczanie enancjomerów L- i D-kwasu mlekowego (Rysunek 1) i ich późniejsza kwantyfikacja ma kluczowe znaczenie u niemowląt, ponieważ znaczny nadmiar produkcji D-kwasu mlekowego może prowadzić do kwasicy metabolicznej skutkującej poważnymi objawami neurologicznymi, jeśli nie jest leczona. W związku z tym kwas D-mlekowy może być markerem klinicznym do diagnozowania tych chorób. W związku z tym oznaczanie poziomu kwasu mlekowego, a zwłaszcza kwasu D-mlekowego, ma ogromne znaczenie w diagnostyce klinicznej. Istnieje potrzeba opracowania niezawodnej i selektywnej metody wykrywania i ilościowego oznaczania kwasu D-mlekowego. Niniejsza praca demonstruje opracowanie nowej i wysoce czułej metody analitycznej do jednoczesnego oznaczania i kwantyfikacji enancjomerów L- i D-kwasu mlekowego. Metoda demonstruje zastosowanie chiralnej kolumny Astec CHIROBIOTIC^® R firmy Supelco w LC-MS/MS do chiralnego rozdzielania enancjomerów kwasu L- i D-mlekowego. Ponadto liniowość i precyzja tej metody są dobre. Ta aplikacja jest szybka, prosta i powtarzalna do rutynowego klinicznego wykrywania enancjomerów L- i D-kwasu mlekowego.

Izomery L- i D-kwasu mlekowego mogą przyczyniać się do kwasicy metabolicznej, ale ich względny wkład jest rozróżnialny ze względu na ich różne pochodzenie i szlaki metaboliczne. Dlatego ważne jest rozróżnienie izomerów kwasu mlekowego w osoczu, aby zrozumieć ich względny udział w kwasicy metabolicznej. Jednak ze względu na podobne właściwości fizyczne i chemiczne obu enancjomerów, trudno jest określić izomery kwasu mlekowego w próbkach biologicznych. Dlatego konieczne jest opracowanie czułej i niezawodnej metody oddzielania i ilościowego oznaczania enancjomerów kwasu mlekowego w próbkach moczu. Obecnie do pomiaru zawartości kwasu D-mlekowego w moczu stosuje się testy enzymatyczne z dehydrogenazą kwasu D-mlekowego. Jednak testy enzymatyczne nie są czułe i specyficzne w kontrolach moczu noworodków, ze względu na niskie poziomy kwasu D-mlekowego, które są poniżej poziomu kwantyfikacji metodą enzymatyczną.

Rysunek 1. Struktura L- i D-kwasu mlekowego

Obecne prace wykazały niezawodną i powtarzalną metodę analityczną do jednoczesnego oznaczania i ilościowego oznaczania enancjomerów L- i D-kwasu mlekowego w moczu poprzez oczyszczanie i zatężanie kwasów organicznych, a następnie chromatografię chiralną sprzężoną z tandemowym MS. Metoda ta jest szybka, prosta i skuteczna w rutynowym klinicznym wykrywaniu enancjomerów L- i D-kwasu mlekowego. W metodzie tej zastosowano kolumnę chiralną Astec CHIROBIOTIC R, która jest dostępna tutaj. Dzięki tej metodzie analitycznej, kwas L-mlekowy może być oznaczany ilościowo w zakresie 2-400 ìm/L, a kwas D-mlekowy może być oznaczany ilościowo w zakresie 0.5-100 µm/L, z dokładnością i wysoką precyzją (Rys. 2).

HPLC (izokratyczna w systemie HPLC MS-MS):
Kolumna: Astec CHIROBIOTIC R Chiral Column, 15 cm x 2,1 mm I.D., 5 µm (13019AST)

faza ruchoma:15% (v/v) 33.3 mM octan amonu w H2O i 85% (v/v) acetonitryl

prędkość przepływu: 0,7 mL/mi

temperatura kolumny.4 °C

detektor:MS, ESI(-), MRM, m/z 89.1/43.3, 90.1/44.3, 93.1/46.3

Rysunek 2. Chromatogram LC MS/MS pokazujący chiralne rozdzielenie kwasu L- i D-mlekowego w moczu przy użyciu kolumny Astec CHIROBIOTIC^® R Chiral HPLC Column HPLC (izokratyczna w systemie HPLC MS-MS): kolumna: Astec CHIROBIOTIC^® R Chiral Column, 15 cm x 2,1 mm I.D., 5 µm (Product No. 13019AST); faza ruchoma: 15% (v/v) 33,3 mM octan amonu w H2O i 85% (v/v) acetonitryl; szybkość przepływu: 0,7 mL/min; temp. kolumny: 4 °C; detektor: MS, ESI(-), MRM, m/z 89.1/43.3, 90.1/44.3, 93.1/46.3

Wnioski

Kolumna chiralna Astec CHIROBIOTIC^® R jest najbardziej odpowiednia do enancjorozdzielania kwasów hydrofilowych, takich jak kwasy alfa-hydroksy/halogenowane i aminokwasy z blokadą N. Unikalny charakter jonowy tej fazy i zdolność wiązań H odgrywają ważną rolę w mechanizmie rozpoznawania chiralności. Oferujemy również szereg innych chiralnych faz stacjonarnych, które mogą być stosowane w powyższej wydajności do rozdzielania enancjomerów różnych cząsteczek.

Referencje

1. Henry H, Marmy Conus N, Steenhout P, Béguin A, Boulat O. 2012. ensitive determination of D-lactic acid and L-lactic acid in urine by high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. [Internet]. National Library of Medicine. Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21842515/