Wskazówki i porady HPLC - Przygotowanie fazy ruchomej
Dr. Egidijus Machtejevas, Lead Expert, Analytical Science Liaison
Artykuł z Analytix Reporter - Wydanie 10
Wprowadzenie
Najważniejszą częścią zestawu chromatograficznego jest kolumna. Ale nawet jeśli zapewnia ona retencję, ostateczny rozdział zależy również w dużym stopniu od fazy ruchomej (MP). Różne efekty oferowane przez fazę ruchomą wpływają na retencję i migrację różnicową (selektywność) substancji rozpuszczonych przez kolumnę. Dlatego też, podczas opracowywania i optymalizacji metody, rozdział może wymagać dostrojenia poprzez zmianę parametrów fazy ruchomej, takich jak rodzaj rozpuszczalnika, dodatki (różne bufory, odczynniki do par jonowych) lub warunki pracy (czas/stopień gradientu, temperatura, natężenie przepływu).
Często problemy z rozdziałem chromatograficznym są związane z nieprawidłowo/niekonsekwentnie przygotowaną fazą ruchomą. W związku z tym można zaobserwować tendencję do stosowania prostszych faz ruchomych ze względów praktycznych, takich jak zwiększona odporność metody, łatwiejszy transfer metody i łatwość użycia (np. w diagnostyce klinicznej lub kontroli procesu).
Czystość dodatku rozpuszczalnika/fazy ruchomej
Większość z Was zna zasadę: "śmieci wrzuć, śmieci wyrzuć". To powiedzenie jest szczególnie prawdziwe przy wyborze właściwej czystości składników fazy ruchomej. Na przykład absolutną koniecznością jest stosowanie rozpuszczalników i odczynników do separacji gradientowej, aby uzyskać dokładną, powtarzalną i czystą linię bazową (wolną od pików widmowych) oraz czułą separację chromatograficzną (patrz także Wskazówki i porady dotyczące HPLC w Analytix Reporter 9 "Zwiększ czułość metody HPLC/UHPLC"). Używanie właściwej i odpowiedniej klasy rozpuszczalników w zależności od zastosowania (np. hypergrade dla LC-MS dla metod LC-MS, zobacz więcej na SigmaAldrich.com/Solvents) również minimalizuje ryzyko zanieczyszczenia i wydłuża żywotność kolumny chromatograficznej.
W przypadkach wymagających dodania jakiegokolwiek odczynnika, takiego jak bufor, należy upewnić się, że odczynnik spełnia wymaganą jakość i nie upłynął jego termin ważności. Degradanty z przeterminowanych dodatków prowadzą do pików widmowych na chromatogramach próbek. Niektóre dodatki ulegają szybszej degradacji, w zależności od ich charakteru (na przykład 20 mM bufor fosforanowy o pH 7). Niewłaściwe/nieostrożne obchodzenie się z odczynnikami (np. włożenie resztek rozpuszczalnika z powrotem do butelki, pozostawienie butelki na stole laboratoryjnym bez zakrętki, zgubienie końcówek do pipet pływających wewnątrz butelki itd.) powoduje szybkie psucie się odczynników.
Mieszanie faz ruchomych
W przypadku separacji izokratycznych z użyciem wstępnie zmieszanych faz ruchomych, podczas ich przygotowywania należy wziąć pod uwagę skurcz objętościowy rozpuszczalnika w powszechnie stosowanych mieszaninach (woda/acetonitryl, metanol lub tetrahydrofuran). Jedynym prawidłowym sposobem przygotowania takich mieszanin faz ruchomych jest oddzielne pobranie dokładnie odmierzonych objętości składników i zmieszanie ich. Na przykład, aby uzyskać 70% organiczną fazę ruchomą, 300 ml wody i 700 ml rozpuszczalnika organicznego należy dokładnie odmierzyć oddzielnie, a następnie połączyć w kolbie. Ale jeśli tylko woda zostanie dokładnie odmierzona, a następnie rozpuszczalnik organiczny zostanie dodany w celu uzupełnienia wymaganej objętości końcowej, ze względu na kurczenie się mieszaniny rozpuszczalników, wynikowa moc rozpuszczalnika będzie nieco wyższa (lub słabsza w przypadku, gdy rozpuszczalnik organiczny został dodany jako pierwszy, a woda została dodana później). W przypadku wstępnego mieszania MP należy zwrócić uwagę na toksyczne opary rozpuszczalnika, które mogą być emitowane pod wyciągiem.
Obecnie gradienty są generalnie prawidłowo formułowane przy użyciu pomp gradientowych; jednak pewne niewielkie różnice w zachowaniu retencji można zaobserwować podczas porównywania instrumentów z niskociśnieniowymi i wysokociśnieniowymi systemami gradientowymi ze względu na ich mechanizmy mieszania.
Osobiście, w chromatografii z odwróconymi fazami, preferuję metody HPLC ze wstępnie zmieszanymi fazami ruchomymi, takimi jak 5% acetonitrylu w wodzie i/lub 5% wody w acetonitrylu. Uzasadnieniem takich preferencji jest zwiększenie skuteczności odgazowywania, uniknięcie ogrzewania mieszaniny (np. metanolu w wodzie) lub chłodzenia (np. acetonitrylu w wodzie) podczas mieszania, a także poprawa wydajności mieszania poprzez upodobnienie dwóch faz ruchomych pod względem lepkości i napięcia powierzchniowego. Ograniczeniem takich wstępnie zmieszanych rozpuszczalników jest to, że moc rozpuszczalnika fazy ruchomej B nie może wynosić 100% i dodatkowy etap przygotowania fazy ruchomej - co jest dodatkowym, potencjalnym źródłem błędu. Zazwyczaj zaleca się stosowanie rozpuszczalników fazy ruchomej bezpośrednio z ich pojemników, aby zapobiec dodatkowym szansom na zanieczyszczenie.
Ostatnim krokiem w przygotowaniu fazy ruchomej jest filtracja. Istnieje wiele różnych rodzajów filtrów, które można wybrać w zależności od filtrowanych rozpuszczalników. Zalecane są filtry membranowe o wielkości porów co najmniej 0,45 µm dla systemów HPLC i 0,22 µm dla systemów UHPLC. Filtrowanie usuwa cząstki z przygotowanej fazy ruchomej i zapobiega zatykaniu się systemu i kolumny.
Zobacz więcej na temat przygotowania fazy ruchomej w HPLC Tips & Tricks: Przygotowanie fazy ruchomej, część 2 - Bufory.
Inne wskazówki i triki HPLC
Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.
Nie masz konta użytkownika?