Certyfikowane materiały referencyjne dla 19F NMR
Romana Rigger, Alexander Rück, Christine Hellriegel, Robert Sauermoser, Fabienne Morf, Kathrin Breitruck, Markus Obkircher
W ostatnich latach ilościowa spektroskopia NMR (qNMR) stała się jednym z najważniejszych narzędzi do oznaczania zawartości substancji organicznych i ilościowej oceny zanieczyszczeń. Wdrożenie qNMR w nowych obszarach zastosowań, np. metabolomice, analizie środowiskowej i badaniach szlaków fizjologicznych, niesie ze sobą bardziej złożone cząsteczki i systemy, co sprawia, że korzystanie z 1H-qNMR stanowi wyzwanie. Inteligentne obejście tego problemu jest możliwe dzięki zastosowaniu innych aktywnych jąder NMR, a mianowicie 31P i 19F.
W naszym zakładzie produkcyjnym w Buchs (Szwajcaria) używamy qNMR od 2009 roku do produkcji certyfikowanych materiałów referencyjnych (CRM) identyfikowalnych z jednostką SI, zgodnie z akredytacją ISO/IEC 17025 i ISO Guide 34 (od 2017 roku: ISO 17034) (przykład łańcucha identyfikowalności pokazano na Rysunku 1). Gama produktów Trace CERT® organicznych CRM odpowiednich do HPLC lub GC jest certyfikowana przy użyciu tej techniki i obejmuje ponad 200 produktów, w tym pestycydy, witaminy, aminokwasy, plastyfikatory, WWA, antybiotyki, FAME i wiele innych grup produktów. Oprócz tej gamy produktów zapewniamy również zestaw wzorców qNMR identyfikowalnych z materiałem pierwotnym z NIST (National Institute of Standards and Technology, USA) lub NMIJ (National Metrology Institute of Japan), patrz SigmaAldrich.com/qnmr. Rozszerzenie tej standardowej linii produktów qNMR o nowe, interesujące CRM jest w toku i do chwili obecnej opracowano 16 różnych 1H qNMR CRM o znanych wartościach czystości i małych rozszerzonych niepewnościach pomiarowych. Obejmują one cały zakres spektralny i rozpuszczalności, umożliwiając dostęp do certyfikacji qNMR setek produktów organicznych.
Rysunek 1.Łańcuch identyfikowalności flutamidu. Certyfikację przeprowadzono przez porównanie z 2,4-DCBTF (kalibrator wtórny) i 3,5-BTFMBA (kalibrator pierwotny), a na koniec z jednostką SI. MB = bilans masowy, FPD = obniżenie temperatury krzepnięcia, CAT = kulometryczne miareczkowanie acydymetryczne.
W niektórych przypadkach, 1H qNMR osiąga swoje granice, szczególnie w odniesieniu do certyfikacji złożonych i większych cząsteczek. Jednak nowe obszary zastosowań często wiążą się również z obecnością heteroatomów, a mianowicie 31P i 19F. Dlatego wprowadziliśmy 4 CRM dla 31P qNMR z możliwością śledzenia do SI.
W następnej sekcji opisano rozwój CRM do 19F qNMR. Ten artykuł jest fragmentem naszego artykułu AOAC opublikowanego w 2017 roku. Więcej informacji można znaleźć w tym dokumencie.1
Kwas 3,5-bis(trifluorometylo)benzoesowy (3,5-BTFMBA, NMIJ CRM 4601-a) jest podstawowym CRM do stosowania w 1H i 19F qNMR certyfikowanym przez NMIJ. Zakres przesunięcia NMR dla 19F jest bardzo duży, ale okno dla wzbudzenia liniowego, które jest niezbędne dla 19F qNMR, jest dość małe i zależy od natężenia pola i parametru NMR. Techniki przeciwdziałania temu dylematowi zostały opublikowane wcześniej, w tym wykorzystanie nowych eksperymentów NMR. Dlatego postanowiliśmy opracować qNMR CRM z pikami w różnych regionach przesunięcia, które można następnie wybrać odpowiednio do przesunięcia analitów i zastosować w standardowych 19F eksperymentach qNMR. Dwa z najczęstszych elementów struktury to grupy CF3 i atomy fluoru związane bezpośrednio z podstawionymi związkami aromatycznymi. Przesunięcia w 19F w grupach CF3 pojawiają się w około -55 do -90 ppm, podczas gdy przesunięcia atomów fluoru związanych z związkami aromatycznymi można znaleźć między około -110 a -180 ppm. Inne elementy struktury wykazują sygnały między -70 a -140 ppm (CF2) lub między -120 a -240 ppm (atomy fluoru w nasyconych i nienasyconych związkach alifatycznych).
Opracowaliśmy trzy różne CRMy qNMR 19F. Zostały one wybrane na podstawie różnych parametrów, w tym rozpuszczalności, stabilności, jednorodności, czystości i zakresu przesunięcia. Jako warunek wstępny wykazania identyfikowalności z SI i koncepcją certyfikacji, wybraliśmy cząsteczki, które niosą zarówno 1H, jak i 19F jądra. 2,4-dichlorobenzotrifluorek (2,4-DCBTF, nr kat. 53396) jest cieczą, a grupa CF3 wykazuje singlet przy -61,2 ppm w widmie 19F, w zależności od rozpuszczalnika (DMSO-d6 ). Trzy protony aromatyczne wykazują analizowalne sygnały między 7,5 a 8,5 ppm w widmie 1H (DMSO-d6). 2-Chloro-4-fluorotoluen (2Cl4FT, nr kat. 80730) jest również ciekły, a atom fluoru związany z pierścieniem aromatycznym wykazuje multiplet przy -115,3 ppm
(DMSO-d6) w widmie 19F. W widmie 1H ponownie trzy protony aromatyczne wykazują piki między 7,0 a 8,0 ppm, a dodatkowy pik można znaleźć dla grupy metylowej przy około 2,3 ppm (DMSO-d6). 4,4'-Difluorobenzofenon
(4,4'-DFBP, nr kat. 07563) jest stały, a dwa symetryczne atomy fluoru wykazują multiplet przy około -106,5 ppm
(DMSO-d6) w widmie 19F. Osiem aromatycznych protonów daje sygnały między 7,0 a 8,0 ppm (DMSO-d6). Wszystkie trzy związki są rozpuszczalne w popularnych rozpuszczalnikach organicznych NMR. Masy cząsteczkowe wynoszą 215 g/mol (2,4-DCBTF), 144,57 g/mol (2Cl4FT) i 218,2 g/mol (4,4'-DFBP). Wartości czystości, rozszerzone niepewności pomiarowe, przesunięcia charakterystyczne dla rozpuszczalników NMR i czasy relaksacji (T1) można znaleźć w Tabeli 1.
Techniczne aspekty 19F qNMR
Charakterystyczną cechą 19F NMR są 13C i 12C satelity, które są obecne w widmie NMR. Interakcja 19F z 12C i 13C prowadzi do efektu izotopowego, a tym samym do niesymetrycznych satelitów z jednej strony i do wielu satelitów wokół głównego piku w widmach nieodsprzężonych z drugiej strony. Dodatkowo, kształty pików różnią się w zależności od elementu struktury. Ogólnie rzecz biorąc, piki CF3 wykazują wzór sygnału singletowego, a atomy aromatyczne związane 19F wzór sygnału multipletowego.
Podobnie jak w 31P qNMR, podczas 19F qNMR zastosowano odwrotne bramkowane odsprzęganie. Użycie tej metody zamiast np. odsprzęgania bramkowanego mocą minimalizuje narastanie NOE (Nuclear Overhauser Effect). W tym eksperymencie odsprzęganie jest stosowane tylko podczas akwizycji danych, co pozwala układowi spinowemu osiągnąć równowagę między etapami odsprzęgania. Stosując odwrotne bramkowane odsprzęganie, pojawia się tylko jeden satelita, który znajduje się tylko po jednej stronie głównego piku (Rysunek 2). Podczas wykonywania testów wstępnych zarejestrowano zestaw widm odsprzężonych i sprzężonych w celu rozróżnienia satelitów i zanieczyszczeń. Integracja widm odłączonych (Rysunek 2) została przeprowadzona z uwzględnieniem obu satelitów, tylko satelity 12C lub, jeśli to możliwe, bez sygnałów między 7,5 a 8,5 ppm w satelicie widma 1H. Niezależnie od wybranej możliwości, integrację przeprowadzono w taki sam sposób dla wzorca wewnętrznego i związku próbki w odniesieniu do szerokości linii. Podobnie jak 13C, jądro 19F ma szeroki zakres przesunięcia chemicznego. Aby wykonać pomiary ilościowe, wymagane jest szerokopasmowe wzbudzenie na całej szerokości widma. Ze względu na niewystarczającą dostępną moc częstotliwości radiowej dla wzbudzenia impulsowego, intensywność sygnału, a tym samym integracja sygnału może być podatna na błędy. Efekt ten prowadzi do stosunkowo wąskich zakresów częstotliwości (15-30 kHz, 600 MHz NMR, impuls 90°), w których można zagwarantować dokładną kwantyfikację. Wymaga to solidnych testów wstępnych, a następnie dokładnego dostosowania szerokości widma i przesunięcia częstotliwości nadajnika. Ponadto ważne jest, aby ustawić czas akwizycji tak krótki, jak to możliwe, aby uniknąć gromadzenia się NOE, ale wystarczająco długi, aby uniknąć utraty jakości widmowej przez obcięcie swobodnego rozpadu indukcyjnego (FID). Wymaga to dodatkowej analizy FID przed pomiarami ilościowymi. Wszystkie eksperymenty 19F NMR zostały przeprowadzone na instrumencie Bruker Avance III 600 MHz NMR wyposażonym w głowicę Prodigy TCI.
Rysunek 2. A: Sygnał 19F NMR flutamidu w widmach sprzężonych (19F) i rozłączonych (19F(13C)). Różowy punkt to zanieczyszczenie. Satelity są asymetrycznie rozmieszczone wokół głównego piku w widmach sprzężonych. B: Przykład integracji 2,4-DCBTF (analit) i 3,5-BTFMBA (wzorzec wewnętrzny). Oba sygnały zostały zintegrowane bez zewnętrznego satelity.
Mimo zastosowania standardowej sondy (zamiast dedykowanej sondy 19F) można było zapewnić dobrą jakość widmową. Zniekształcenia tła spowodowane materiałami głowicy sondy i rurki próbki, przebicie impulsu i artefakty dzwonienia wpływają na jakość widma, zwłaszcza na linię bazową (rolling baseline), która jest typowa dla 19F, 11B i 29Si i wzrasta podczas pomiaru na dużej szerokości widma. Można temu przeciwdziałać, stosując dodatkowe etapy przetwarzania (naprawa FID poprzez wycięcie pierwszych punktów danych przed transformacją danych) lub zwiększając opóźnienie skanowania wstępnego. W 19F eksperymentach qNMR podczas opracowywania naszych CRM zastosowano zwiększone opóźnienie przed skanowaniem i nie wykonano cięcia FID. Czasy T1 zostały określone przez eksperymenty odzyskiwania inwersji. Typowe czasy T1 dla 19F qNMR CRM wynoszą od 1,2 do 4,8 s w zależności od stężenia mieszaniny i rozpuszczalnika. Pomnożenie czasów T1 przez współczynnik 7-10 daje czasy D1 od 20 do 35 s.
CRM dla 19F qNMR - identyfikowalność do SI poprzez pierwotny CRM
Podobnie jak w badaniu opublikowanym dla 31P, schemat identyfikowalności dla 19F qNMR CRM został opracowany w celu zagwarantowania identyfikowalności z jednostką SI i wykazania porównywalności eksperymentów 1H i 19F qNMR, a tym samym niezależności wyniku mierzonego jądra (Rysunek 3, C). Jako podstawowy materiał referencyjny wybrano 3,5-BTFMBA z Narodowego Instytutu Metrologii Japonii. Ten materiał referencyjny jest bardzo czysty (99,96%), ma bardzo małą rozszerzoną niepewność pomiaru (0.06 %, k=2), a dwie symetryczne grupy CF3 wykazują ostry 19 sygnał F przy -61,3 ppm (w DMSO-d6). Trzy protony aromatyczne dają sygnały około 8,2 - 8,6 ppm (DMSO-d6), w zależności od rozpuszczalnika. 3,5-BTFMBA jest rozpuszczalny we wszystkich popularnych rozpuszczalnikach organicznych i jest określony przez NMIJ dla 1H i 19F qNMR.
Rysunek 3.Łańcuchy identyfikowalności dla 1H (A), 31P (B) i 19F (C) qNMR CRM. Różowe strzałki symbolizują pomiary 1H qNMR, niebieskie strzałki pomiary 31P, a zielone strzałki pomiary 19F qNMR. Jasnoszare pola oznaczają pierwotny materiał odniesienia, ciemnoszare pola 1HTraceCERT® qNMR CRM, ciemnoniebieskie i ciemnozielone pola 31P i 19F TraceCERT® qNMR CRM oraz jasnoniebieskie i jasnozielone pola substancji testowych (chromatografia TraceCERT® CRM).
Wartość czystości 2,4-DCBTF została potwierdzona przez 19F i 1H qNMR przy użyciu 3,5-BTFMBA. Drugi sposób certyfikacji został przeprowadzony z 1H qNMR przy użyciu 1,2,4,5-tetrachloro-3-nitrobenzenu (TCNB, nr kat. 40384) z identyfikowalnością do podstawowego CRM BA (NIST SRM® 350b). Trzy wartości czystości i ich rozszerzone niepewności pomiarowe są idealnie zgodne (SD = 0,015, Rysunek 4). Wartości dla uc(CRM) (k=2) są również porównywalne między różnymi eksperymentami (0.25 - 0,29 %).
Z powodu różnych kształtów sygnału i obszarów widmowych pików, 2Cl4FT i 4,4'-DFBP zostały certyfikowane inną drogą. Identyfikowalność do SI dla 2Cl4FT została osiągnięta poprzez określenie ułamka masowego za pomocą 1H qNMR przy użyciu 3,5-BTFMBA. W drugim sposobie jako wzorzec wewnętrzny zastosowano benzoesan benzylu (BBO). Trzecia wartość została przypisana przez 19F qNMR przy użyciu 4,4'-DFBP jako wzorca wewnętrznego. Wartości czystości z trzech różnych pomiarów pokrywają się w ramach ich rozszerzonych niepewności pomiarowych i ponownie wykazują dobrą zgodność (SD = 0,053, Rysunek 4). Wartości niepewności uc(CRM) (k=2) są podobne do wartości dla 2,4-DCBTF (0,24 - 0,41%).
Wartość czystości 4,4'-DFBP została potwierdzona poprzez 1H qNMR przy użyciu 3,5-BTFMBA, a w drugim sposobie kwas maleinowy (MA, nr kat. 92816).nr kat. 92816), jako wzorzec wewnętrzny. 19F qNMR certyfikacja została przeprowadzona przy użyciu 2Cl4FT, pokazując ponownie niezależność wyniku obserwowanego jądra. Wszystkie trzy wartości są porównywalne, a SD trzech wyników jest niewielkie (SD = 0,055, Rysunek 4). Wartości uc(CRM) są nieco wyższe w porównaniu z pozostałymi dwoma 19F qNMR CRM (0,30 do 0,37%). Zwiększone niepewności (np, 0,41%, 2Cl4F2 i 0,37% 4,4'-DFBP) nie wynikają z procedury pomiarowej, ale są spowodowane wyższym wkładem niepewności przez wzorzec wewnętrzny (4,4'-DFBP, MA) i jednorodność materiału. We wszystkich innych 19F certyfikatach ogólna powtarzalność pomiaru stanowi najbardziej znaczący wkład niepewności.
Rysunek 4. Widmo 19F pokazujące przesunięcia różnych wtórnych CRM i pierwotnego CRM 3,5-BTFMBA. W zależności od elementu struktury (CF3 lub aromatyczny związany F) piki są przesunięte w różne regiony. Przedstawiono wyniki oznaczania czystości drugorzędowych CRM za pomocą 19F i 1H qNMR oraz przy użyciu różnych wzorców wewnętrznych. Różne wartości czystości analitu (PCRM) mieszczą się w ich rozszerzonych niepewnościach pomiarowych uCRM. Certyfikowane wartości dla 2,4-DCBTF, 4,4'-DFBP i 2Cl4FT są pogrubione, a CRM 4601-a został wybrany jako główny CRM dla tych trzech. Ze względu na przesunięcia chemiczne w widmie NMR, bezpośrednie porównanie na podstawie 19F było możliwe tylko w przypadku 2,4-DCBTF. W przypadku 4,4'-DFBP i 2Cl4FT konieczne było zastosowanie 1H qNMR, ale także odniesienie do CRM 4601-a. Flutamid można było zmierzyć na oba sposoby.
Ostatni eksperyment został przeprowadzony w celu przypisania wartości czystości do TraceCERT® Flutamide CRM. Możliwe było wykazanie, że za pomocą 19F qNMR i przy użyciu 2,4-DCBTF jako wzorca wewnętrznego, osiągnięto porównywalne wyniki, jak za pomocą 1H qNMR przy użyciu ustalonego CRM (BBO). Ponownie, ogólna powtarzalność pomiaru stanowi najbardziej znaczący wkład niepewności, który jest tego samego rzędu dla certyfikacji poprzez 1H i 19F. Wartości czystości pokrywają się w ramach ich rozszerzonych niepewności pomiarowych (Rysunek 4), co ponownie jest wyraźnym wskaźnikiem, że 19F qNMR może być rutynowo stosowany jako samodzielna metoda przypisywania czystości substancji fluoroorganicznych.
Wnioski
Podsumowując, qNMR wykorzystujący 1H, 31P lub 19F TraceCERT® CRMs jest bardzo wartościową metodą. Przedstawiliśmy wrażliwe aspekty, które są ważne dla dokładnej certyfikacji qNMR i wymagają szczególnej świadomości operatora. Przedstawiony zestaw 1H, 31P i 19F qNMR CRM jest produkowany zgodnie z wymaganiami dla producenta materiałów referencyjnych w ramach akredytacji ISO 17034, obejmującej dodatkowe dane, takie jak jednorodność materiału oraz stabilność krótko- i długoterminowa.
Referencje
Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.
Nie masz konta użytkownika?