Protokół TRI Reagent^®

Do czego służy TRI Reagent^® roztwór?

TRI Reagent^® roztwór (sprzedawany również jako TRIzol) jest mieszaniną mieszaniną tiocyjanianu guanidyny i fenolu w jednofazowym roztworze, który jest stosowany do izolacji DNA, RNA i białek z próbek biologicznych ludzi, zwierząt, roślin, drożdży, bakterii i wirusów. Hamuje aktywność RNazy. TRI Reagent^® służy do homogenizacji próbki biologicznej, z której ekstrahuje się RNA, DNA lub białka.

Procedury

Przygotowanie próbki

1A. Tkanka:
Homogenizuj próbki tkanek w odczynniku TRI (1 ml na 50-100 mg tkanki) w urządzeniu Polytron^® lub innym odpowiednim homogenizatorze.

Uwaga: Jeśli pożądane jest minimalne ścinanie DNA, należy użyć luźno dopasowanego homogenizatora, a nie Polytronu (patrz Izolacja DNA, krok 3, uwaga b). Objętość tkanki nie powinna przekraczać 10% objętości odczynnika TRI.

1B. Komórki jednowarstwowe:
Liofilizować komórki bezpośrednio na szalce hodowlanej. Użyć 1 ml odczynnika TRI na 10 cm² powierzchni szklanej płytki hodowlanej. Po dodaniu odczynnika lizat komórkowy należy kilkakrotnie przepuścić przez pipetę w celu uzyskania jednorodnego lizatu.

Uwaga:  Odczynnik TRI nie jest kompatybilny z plastikowymi płytkami do hodowli.

1C. Zawiesina komórek:
Odizolować komórki przez odwirowanie, a następnie lizować w odczynniku TRI przez wielokrotne pipetowanie. Jeden ml odczynnika wystarcza do lizy 5-10 × 10⁶ komórek zwierzęcych, roślinnych lub drożdżowych, lub 10⁷ komórek bakteryjnych.

Uwaga:

• Jeśli próbki mają wysoką zawartość tłuszczu, białka, polisacharydów lub materiału pozakomórkowego, takiego jak mięśnie, tkanka tłuszczowa i bulwiaste części roślin, może być potrzebny dodatkowy krok. Po homogenizacji należy odwirować homogenat z prędkością 12 000 × g przez 10 minut w temperaturze 2-8 °C w celu usunięcia nierozpuszczalnego materiału (błon zewnątrzkomórkowych, polisacharydów i DNA o wysokiej masie cząsteczkowej). Supernatant zawiera RNA i białko. Jeśli próbka miała wysoką zawartość tłuszczu, na powierzchni fazy wodnej będzie znajdować się warstwa materiału tłuszczowego, którą należy usunąć. Przenieś klarowny supernatant do świeżej probówki i przejdź do kroku 2. Odzyskaj DNA o wysokiej masie cząsteczkowej z osadu, postępując zgodnie z Izolacja DNA, kroki 2 i 3.
• Niektóre komórki drożdży i bakterii mogą wymagać homogenizatora.
• Po homogenizacji lub lizie komórek w odczynniku TRI, próbki mogą być przechowywane w temperaturze -70 °C przez okres do 1 miesiąca.

Rozdzielanie faz: Aby zapewnić całkowitą dysocjację kompleksów nukleoproteinowych, pozostaw próbki na 5 minut w temperaturze pokojowej. Dodać 0,1 ml 1-bromo-3-chloropropanu lub 0,2 ml chloroformu (patrz Rozdzielanie faz, uwaga a i b) na każdy ml odczynnika TRI Reagent. Szczelnie przykryć próbkę, energicznie wstrząsać przez 15 sekund i odstawić na 2-15 minut w temperaturze pokojowej. Odwirować powstałą mieszaninę z prędkością 12 000 × g przez 15 minut w temperaturze 2-8 °C. Wirowanie rozdziela mieszaninę na 3 fazy: czerwoną fazę organiczną (zawierającą białko), interfazę (zawierającą DNA) i bezbarwną górną fazę wodną (zawierającą RNA).

Uwaga:

• 1-Bromo-3-chloropropan jest mniej toksyczny niż chloroform, a jego użycie do rozdzielania faz zmniejsza możliwość zanieczyszczenia RNA DNA.⁴
• Chloroform używany do separacji faz nie powinien zawierać alkoholu izoamylowego ani innych dodatków.
• W celu izolacji frakcji poli A⁺ z fazy wodnej patrz Dodatek I.

Izolacja lub ekstrakcja RNA

1. Przenieść fazę wodną do świeżej probówki i dodać 0.5 ml 2-propanolu na ml odczynnika TRI użytego w przygotowaniu próbki, kroku 1 i wymieszać. Pozostawić próbkę na 5-10 minut w temperaturze pokojowej. Wirować z prędkością 12 000 × g przez 10 minut w temperaturze 2-8 °C. Osad RNA utworzy osad z boku i na dnie probówki.

Uwaga: Przechowywać interfazę i fazę organiczną w temperaturze 2-8 °C do późniejszej izolacji DNA i białek.

2. Usunąć supernatant i przemyć osad RNA dodając co najmniej 1 ml 75% etanolu na 1 ml odczynnika TRI użytego w przygotowaniu próbki, krok 1. Worteksować próbkę, a następnie odwirować z prędkością 7 500 × g przez 5 minut w temperaturze 2-8 °C.

Uwaga:

• Jeśli osad RNA unosi się na powierzchni, przepłucz w 75% etanolu przy 12,000 × g.
• Próbki mogą być przechowywane w etanolu w temperaturze 2-8 °C przez co najmniej 1 tydzień i do 1 roku w temperaturze -20 °C.

3. Krótko osusz osad RNA przez 5-10 minut susząc na powietrzu lub pod próżnią. Nie należy dopuścić do całkowitego wyschnięcia peletu RNA, ponieważ znacznie zmniejszy to jego rozpuszczalność. Nie suszyć osadu RNA przez wirowanie pod próżnią (Speed-Vac®). Dodaj odpowiednią objętość formamidu, wody lub 0,5% roztworu SDS do osadu RNA. Aby ułatwić rozpuszczenie, wymieszać przez wielokrotne pipetowanie mikropipetą w temperaturze 55-60 °C przez 10-15 minut.

Uwaga:

• Końcowy preparat RNA jest wolny od DNA i białek. Powinien mieć stosunek A260 do A280 ≥1.7.
• Typowe wydajności z tkanek (mg RNA/mg tkanki): wątroba, śledziona, 6-10 mg; nerki, 3-4 mg; mięśnie szkieletowe, mózg, 1-1.5 mg; łożysko, 1-4 mg.
• Typowa wydajność z hodowanych komórek (mg RNA/106 komórek):  komórki nabłonkowe, 8-15 mg; fibroblasty, 5-7 mg.
• Barwienie RNA bromkiem etydyny w żelach agarozowych wizualizuje dwa dominujące pasma małego (2 kb) i dużego (5 kb) rybosomalnego RNA o niskiej masie cząsteczkowej (0. 1-0.3 kb) RNA.1-0,3 kb) RNA i dyskretne pasma RNA o wysokiej masie cząsteczkowej (7-15 kb).

Izolacja lub ekstrakcja DNA

1. Ostrożnie usunąć pozostałą fazę wodną pokrywającą interfazę i wyrzucić. W celu wytrącenia DNA z fazy międzyfazowej i organicznej, dodać 0,3 ml 100% etanolu na 1 ml odczynnika TRI użytego do przygotowania próbki, krok 1. Wymieszać przez odwrócenie i pozostawić na 2-3 minuty w temperaturze pokojowej. Wirować przy 2000 × g przez 5 minut w temperaturze 2-8 °C.

Uwaga: Usunięcie pozostałej fazy wodnej przed wytrąceniem DNA jest krytycznym krokiem dla jakości wyizolowanego DNA.

2. Usunąć supernatant i zachować w temperaturze 2-8 °C do izolacji białka. Przemyć osad DNA dwukrotnie w 0,1 M roztworze cytrynianu trisodu i 10% roztworze etanolu. Użyć 1 ml roztworu płuczącego na każdy 1 ml odczynnika TRI użytego do przygotowania próbki, krok 1. Podczas każdego płukania pozostawić osad DNA na co najmniej 30 minut (od czasu do czasu mieszając). Wirować z prędkością 2000 × g przez 5 minut w temperaturze 2-8 °C. Zawiesić osad DNA w 75% etanolu (1,5-2 ml na każdy ml odczynnika TRI) i pozostawić na 10-20 minut w temperaturze pokojowej.

Uwaga:

• Ważne: Nie skracaj czasu pozostawania próbek w roztworze płuczącym. Trzydzieści minut to absolutne minimum dla skutecznego usunięcia fenolu z DNA.
• Jeśli osad zawiera 200 mg DNA lub duże ilości materiału innego niż DNA, wymagane jest dodatkowe płukanie w 0,1 M roztworze cytrynianu trisodu i 10% roztworze etanolu.
• Próbki zawieszone w 75% etanolu mogą być przechowywane w temperaturze 2-8 °C przez kilka miesięcy.

3. Osusz osad DNA przez 5-10 minut pod próżnią i rozpuść w 8 mM NaOH, powtarzając powolne pipetowanie mikropipetą. Dodać wystarczającą ilość 8 mM NaOH do uzyskania końcowego stężenia DNA 0,2-0,3 mg/ml (zazwyczaj 0,3-0,6 ml do DNA wyizolowanego z 50-70 mg tkanki lub 107 komórek). Ten łagodny roztwór alkaliczny zapewnia całkowite rozpuszczenie osadu DNA. Wirować przy 12 000 × g przez 10 minut w celu usunięcia nierozpuszczalnego materiału i przenieść supernatant do nowej probówki.

Uwaga:

• Lepki supernatant wskazuje na obecność DNA o wysokiej masie cząsteczkowej.
• Rozmiar DNA będzie zależał od siły wywieranej podczas homogenizacji. Unikaj używania homogenizatora Polytron.
• Próbki rozpuszczone w 8 mM NaOH mogą być przechowywane w temperaturze 2-8 °C przez noc. W przypadku długotrwałego przechowywania, należy dostosować wartość pH do zakresu od 7 do 8 i uzupełnić EDTA (końcowe stężenie 1 mM).
• Aby określić stężenie DNA, należy pobrać porcję, rozcieńczyć wodą i zmierzyć A260.Dla dwuniciowego DNA, 1 jednostka A260/ml = 50 µg/ml.
• Aby obliczyć liczbę komórek, należy przyjąć, że ilość DNA dla 106 diploidalnych komórek człowieka, szczura i myszy wynosi 7.1 µg, 6,5 µg i 5,8 µg, odpowiednio.
• Typowa wydajność z tkanek (µg DNA/mg tkanki): wątroba, nerki, 3-4 µg; mięśnie szkieletowe, mózg i łożysko, 2-3 µg.
• Typowa wydajność z hodowanych komórek ludzkich, szczurzych i mysich: 5-7 µg DNA/106 komórek.

Do amplifikacji DNA metodą PCR

Po rozpuszczeniu w 8 mM NaOH, dostosować do pH 8.4 za pomocą HEPES  (dodaj 86 µL 0,1 M HEPES, wolny kwas/ml roztworu DNA). Dodaj próbkę (zazwyczaj 0,1-1 µg) do mieszaniny PCR i postępuj zgodnie z protokołem PCR.

Trawienie DNA enzymami restrykcyjnymi

Dostosuj pH roztworu DNA do wartości potrzebnej do trawienia enzymami restrykcyjnymi za pomocą HEPES lub dializuj próbki wobec 1 mM EDTA, pH 7-8. Pozostawić trawienie enzymem restrykcyjnym na 3-24 godziny w optymalnych warunkach. Zaleca się stosowanie 3-5 jednostek enzymu na 1 µg DNA. Zazwyczaj 80-90% DNA jest trawione.

Izolacja białek

1. Wytrącić białka (patrz uwaga) z supernatantu fenol-etanol  (Izolacja DNA, krok 2) za pomocą 1.5 ml 2-propanolu na 1 ml odczynnika TRI użytego w Przygotowaniu próbki krok 1. Pozostaw próbki na co najmniej 10 minut w temperaturze pokojowej. Odwirować z prędkością 12 000 × g przez 10 minut w temperaturze 2-8 °C.

Uwaga: W przypadku niektórych próbek osad białka może być trudny do rozpuszczenia w 1% SDS (krok 3). Użyj tej alternatywnej procedury, aby rozwiązać ten problem:

• Dializuj supernatant fenol-etanol wobec 3 zmian 0.1% SDS w temperaturze 2-8°C.
• Wirować dializat z prędkością 10 000 × g przez 10 minut w temperaturze 2-8°C.
• Przezroczysty supernatant zawiera białko, które jest odpowiednie do stosowania w procedurach Western blotting.

2. Odrzucić supernatant i przemyć osad 3 razy w 0.3 M chlorowodorku guanidyny do 95% roztworu etanolu, używając 2 ml na 1 ml odczynnika TRI użytego w Przygotowaniu próbki, kroku 1. Podczas każdego płukania, przechowuj próbki w roztworze płuczącym przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Wirować przy 7 500 × g przez 5 minut w temperaturze 2-8 °C. Po 3 płukaniach dodać 2 ml 100% etanolu i  worteksować osad białkowy. Pozostawić na 20 minut w temperaturze pokojowej. Odwirować przy 7 500 × g przez 5 minut w temperaturze 2-8 °C.

Uwaga: Próbki białek zawieszone w 0.3 M chlorowodorku guanidyny w 95% roztworze etanolu lub 100% etanolu mogą być przechowywane przez 1 miesiąc w temperaturze 2-8°C lub 1 rok w temperaturze -20°C.

3. Osusz osad białkowy pod próżnią przez 5-10 minut. Rozpuścić osad w 1% SDS wspomagając się pracą tłoka mikropipety z końcówką w roztworze. Usunąć nierozpuszczalny materiał przez odwirowanie z prędkością 10 000 g przez 10 minut w temperaturze 2-8 °C. Przenieść supernatant do nowej probówki. Roztwór białka powinien być natychmiast użyty do Western blotting lub przechowywany w temperaturze -20 °C.

Poradnik rozwiązywania problemów

1. Izolacja RNA:

A. Niska wydajność może być spowodowana:

• niekompletną homogenizacją lub lizą próbek.
• końcowy osad RNA mógł nie zostać całkowicie rozpuszczony.

B. Jeśli stosunek A260 do A280 wynosi 1,65:

• ilość próbki użytej do homogenizacji mogła być zbyt mała.
• próbki mogły nie stać w temperaturze pokojowej przez 5 minut po homogenizacji.
• mogło dojść do zanieczyszczenia fazy wodnej fazą fenolową.
• końcowy osad RNA mógł nie zostać całkowicie rozpuszczony.

C. W przypadku degradacji RNA:

• tkanki mogły nie zostać natychmiast przetworzone lub zamrożone po usunięciu ze zwierzęcia.
• próbki użyte do izolacji lub wyizolowane preparaty RNA mogły być przechowywane w temperaturze -20 °C zamiast -70 °C, jak określono w procedurze.
• komórki mogły zostać rozproszone przez trawienie trypsyną.
• roztwory wodne lub probówki użyte do procedury mogły nie być wolne od RNAzy.
• formaldehyd użyty do elektroforezy w żelu agarozowym mógł mieć wartość pH <3.5.

D. W przypadku zanieczyszczenia DNA:

• objętość odczynnika użytego do homogenizacji próbki mogła być zbyt mała.
• próbki użyte do izolacji mogły zawierać rozpuszczalniki organiczne (etanol, DMSO), silne bufory lub roztwór alkaliczny.

2. Izolacja DNA:

A. Niska wydajność może być spowodowana:

• niekompletną homogenizacją lub lizą próbek.
• końcowy osad DNA mógł nie zostać całkowicie rozpuszczony.

B. Jeśli stosunek A260 do A280 wynosi 1,70:

• fenol mógł nie zostać wystarczająco usunięty z preparatu DNA. Spróbuj jeszcze raz przemyć osad DNA 0,1 M cytrynianem trójsodowym, 10% roztworem etanolu.

C.  Jeśli występuje degradacja DNA:

• tkanki mogły nie zostać natychmiast przetworzone lub zamrożone po wyjęciu ze zwierzęcia.
• próbki użyte do izolacji mogły być przechowywane w temperaturze -20 °C zamiast -70 °C, jak określono w procedurze.
• próbki mogły być homogenizowane za pomocą Polytronu lub innego homogenizatora o dużej prędkości.

D.   Jeśli występuje zanieczyszczenie RNA:

• mogło pozostać zbyt dużo fazy wodnej z fazą organiczną i interfazą.
• osad DNA mógł nie zostać wystarczająco przemyty 0,1 M cytrynianem trójsodowym, 10% roztworem etanolu.

3. Izolacja białek:

A. Niska wydajność może być spowodowana:

• niekompletną homogenizacją lub lizą próbek.
• końcowy osad białka mógł nie zostać całkowicie rozpuszczony.

B. W przypadku degradacji białka:

• tkanki mogły nie zostać natychmiast przetworzone lub zamrożone po usunięciu ze zwierzęcia.

C. Jeśli PAGE wykazuje deformację pasma:

• osad białka mógł nie zostać wystarczająco wypłukany.

Dodatek

I.Izolacja poli-A+ RNA
Po wytrąceniu RNA 2-propanolem (Izolacja RNA, krok 1), rozpuścić osad w buforze wiążącym poli- A+ i przepuścić przez kolumnę celulozową oligo-dT w celu selektywnego usunięcia mRNA zgodnie z procedurą.A+ buforze wiążącym i przepuścić przez kolumnę celulozową oligo-dT w celu selektywnego usunięcia mRNA zgodnie z procedurą Aviva i Ledera.³

II.Wyizolowany RNA ma być użyty w RT-PCR

1. Modyfikacja procedury poprzez wykonanie dodatkowego etapu wirowania w początkowym  Przygotowanie próbki, krok 1B, uwaga c dodatkowo minimalizuje możliwość zanieczyszczenia DNA w RNA ekstrahowanym przez TRI Reagent LS.

2. Bardziej kompletne odparowanie etanolu jest wymagane, gdy próbki RNA mają być użyte w RT-PCR. Jest to szczególnie istotne w przypadku próbek o małej objętości (5-20 μL), które mogą zawierać stosunkowo wysoki poziom etanolu, jeśli nie zostaną odpowiednio wysuszone.

3.

Referencje

1. Chomczynski P. 1993. A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples. Biotechniques. 15(3):536-7.

2. Chomczynski P, Sacchi N. 1987. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 162(1):156-159. https://doi.org/10.1016/0003-2697(87)90021-2

3. Aviv H, Leder P. 1972. Purification of Biologically Active Globin Messenger RNA by Chromatography on Oligothymidylic acid-Cellulose. Proceedings of the National Academy of Sciences. 69(6):1408-1412. https://doi.org/10.1073/pnas.69.6.1408

4. Chomczynski P, Mackey K. 1995. Substitution of Chloroform by Bromochloropropane in the Single-Step Method of RNA Isolation. Analytical Biochemistry. 225(1):163-164. https://doi.org/10.1006/abio.1995.1126