Liza i ekstrakcja białek

Dostępnych jest wiele metod rozbijania komórek i przygotowywania ich zawartości do analizy. Ogólnie rzecz biorąc, delikatne metody są stosowane, gdy próbka składa się z łatwo lizowanych komórek hodowlanych lub komórek krwi, podczas gdy bardziej energiczne metody są stosowane do rozbijania bardziej wytrzymałych komórek bakteryjnych lub roślinnych lub komórek ssaków osadzonych w tkance łącznej.

• Liza oparta na detergentach: Liza oparta na detergentach: Liza detergentowa jest delikatną metodą, która może być stosowana do komórek ssaków, komórek bakteryjnych, drożdży i roślin. Zawiesiny komórek są delikatnie odwirowywane i ponownie zawieszane w roztworze lizującym zawierającym detergenty, które powodują przerwanie błony komórkowej. Błony są rozpuszczane, co powoduje lizę komórek i uwolnienie ich zawartości. Detergenty mogą wymagać usunięcia, jeśli przeszkadzają w analizie lub produkcji.
• Liza przez zamrażanie i rozmrażanie: Metoda ta ma zastosowanie do zawiesin komórek ssaków lub bakterii. Zawiesina komórek jest szybko zamrażana przy użyciu ciekłego azotu. Próbka jest następnie rozmrażana i ponownie zawieszana przez pipetowanie lub delikatne worteksowanie w buforze lizującym, powtarzając proces kilka razy. Pomiędzy cyklami próbka jest odwirowywana, a supernatant zawierający rozpuszczalne białko jest zatrzymywany.
• Szok osmotyczny: Jest to bardzo delikatna metoda, która może być wystarczająca do lizy zawieszonych komórek ssaków lub bakterii bez użycia detergentu. Metoda ta, często połączona z rozerwaniem mechanicznym, polega na zmianie pożywki osmotycznej z wysokiej na niską i dobrze nadaje się do zastosowań, w których lizat ma być następnie frakcjonowany na składniki subkomórkowe.
• Ultrasonikacja: Ta metoda ekstrakcji białek jest najczęściej stosowana do zawiesin komórkowych. Komórki są rozbijane falami dźwiękowymi o wysokiej częstotliwości za pomocą sondy umieszczonej w próbce. Fale dźwiękowe generują obszar niskiego ciśnienia, powodując rozerwanie błon komórkowych.
• Metody mechaniczne: Białka mogą być ekstrahowane z komórek i tkanek przy użyciu różnych prymitywnych, ale skutecznych metod "kruszenia i mielenia". Na przykład, błony komórkowe mogą być rozbijane przez siły ścinające cieczy przy użyciu homogenizacji Dounce'a lub Pottera-Elvehjema. Tkanki mogą być homogenizowane przez siekanie lub mielenie w schłodzonym buforze przy użyciu blendera Waring lub homogenizatora Polytron® . Tkanki lub komórki można zamrozić w ciekłym azocie i zmielić na drobny proszek za pomocą moździerza i tłuczka z tlenkiem glinu lub piaskiem. Szybkie mieszanie komórek z drobnymi szklanymi kulkami rozbija ściany komórkowe, skuteczne w przypadku większości bakterii Gram dodatnich i Gram ujemnych.
• Trawienie enzymatyczne: Trawienie enzymatyczne: Metody enzymatyczne są często stosowane podczas ekstrakcji białek z bakterii, drożdży lub komórek eukariotycznych osadzonych w tkankach włóknistych, gdzie błony komórkowe są otoczone solidną strukturą ochronną. Enzymy lizy komórkowej lub koktajle, takie jak lizozym, mutanolizyna, metanolizyna, lizonaza i pronaza mogą być stosowane w połączeniu z enzymami trawiącymi tkanki (tj. kolagenazą, chondroitynazą, hialoronidazą) w celu rozpuszczenia lub rozbicia ścian komórkowych, powłok, kapsułek, kapsydów lub innych struktur, których nie można łatwo przeciąć samymi metodami mechanicznymi. Po trawieniu enzymatycznym może nastąpić homogenizacja, sonikacja lub energiczne worteksowanie w buforze lizującym.

Dodatkowo, ponieważ endogenne proteazy i fosfatazy mogą być uwalniane po rozbiciu komórek i degradować docelową cząsteczkę, próbka powinna być chroniona podczas rozbijania komórek i późniejszego oczyszczania przy użyciu inhibitory proteazy i fosfatazy, aby uniknąć niekontrolowanej utraty celu.