Ekstrakcja białek jądrowych bez detergentów

Detergenty mogą zakłócać skuteczność znakowania ekstrahowanych białek. Dlatego do przygotowania białek jądrowych należy stosować procedurę, która nie obejmuje użycia detergentów.

Do przygotowania białek jądrowych można użyć zestawu do ekstrakcji CellLytic™ NuCLEAR™ (nr produktu  NXTRACT). Należy użyć procedury, która pomija użycie detergentu. Ekstrakt białka jądrowego przygotowany przy użyciu tego zestawu wymaga dializy w celu dostosowania pH przed znakowaniem barwnikami Cy.

Poniższa procedura dotyczy ekstrakcji białka z 200 µL objętości upakowanych komórek (PCV) i reprezentuje procedurę bez detergentu w zestawie.

Uwaga: Poniższa procedura opisuje przygotowanie surowych ekstraktów jądrowych przy użyciu strzykawki lub szklanego homogenizatora tkankowego. Procedura wymaga co najmniej 100 µL PCV. Użycie strzykawki jest zalecane w przypadku preparatów na małą skalę (0,1-1 ml). Przepuszczenie więcej niż 1 ml przez strzykawkę może powodować trudności ze względu na rozmiar igły.

Ekstrakcja z komórek

1. Przygotuj świeży roztwór 0,1M DTT z ultraczystą sterylną wodą.
2. Przygotować bufor lizujący:
       - hipotoniczny: 10 mM HEPES, pH 7,9, z 1.5 mM MgCl₂ i 10 mM KCl.
       - izotoniczny (do ekstrakcji białek z delikatnych komórek): 10 mM Tris HCl, pH 7,5, z 2 mM MgCl₂, 3 mM CaCl₂, 0,3 M Sacharozy.
3. Do 1400 µL buforu lizującego (hipotonicznego lub izotonicznego) dodać 14 µL roztworu 0.1 M DTT i 14 µL Koktajlu Inhibitora Proteazy.
4. Przygotować Bufor Ekstrakcyjny: 20 mM HEPES, pH 7,9, z 1,5 mM MgCl₂, 0,42 M NaCl, 0,2 mM EDTA, 25% (v/v) Glicerol.

Z komórek adherentnych

1. Hoduj komórki do 70-80% konfluencji.
2. Usuń pożywkę wzrostową z komórek.
3. Przepłucz komórki dwukrotnie PBS, uważając, aby nie usunąć żadnych komórek.
4. Odrzuć PBS. Zeskrob komórki używając świeżego PBS i zbierz je do odpowiedniej stożkowej probówki wirówkowej.
5. Wiruj przez 5 minut z prędkością 450 x g.
6. Odcedź i wyrzuć supernatant.
7. Oszacuj objętość upakowanych komórek (PCV).
8. Przejść do kroku 7 procedury dla komórek nieprzylegających.

Z komórek nieprzylegających

1. Zbierz komórki do odpowiedniej stożkowej probówki wirówkowej.
2. Wirować przez 5 minut z prędkością 450 x g.
3. Zlać i odrzucić supernatant.
4. Umyć komórki dwukrotnie przez ponowne zawieszenie osadu komórek w PBS i wirować przez 5 minut przy 450 x g.
5. Odcedzić i odrzucić supernatant.
6. Oszacować objętość upakowanych komórek (PCV).
7. Dodać 1 ml (5X PCV) buforu lizującego (w tym DTT i inhibitory proteazy) do 200 µl PCV.
8. Delikatnie zawiesić osad komórkowy. Unikać tworzenia się piany. W przypadku pracy z małymi objętościami, zawieszone komórki można przenieść do probówki do mikrowirówki.
9. Inkubować zapakowane komórki w buforze do lizy przez 15 minut, pozwalając komórkom pęcznieć.
10. Wirować zawieszone komórki przez 5 minut z prędkością 420 x g. Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad upakowanych komórek w 400 µL (2X PCV) buforu lizującego.
11. Używając szklanego homogenizatora tkankowego, przenieść komórki do szklanej probówki do rozdrabniania tkanek. Rozdrobnić powoli na lodzie pięcioma ruchami w górę i w dół przy użyciu tłuczka typu B. Unikać tworzenia się piany.
    OR
    Używając strzykawki z igłą podskórną o wąskim rozstawie (nr 27), napełnić strzykawkę buforem do lizy. Tłok strzykawki służy do jak najpełniejszego wyparcia buforu. Spowoduje to usunięcie całego powietrza ze strzykawki i zapobiegnie pompowaniu nadmiaru powietrza do zawiesiny komórek podczas lizy. Powoli wciągnąć zawiesinę komórek do strzykawki, a następnie wyrzucić ją jednym szybkim ruchem. Powtórzyć pięć razy.
    Uwaga:
        - Liczba potrzebnych pociągnięć (przy użyciu homogenizatora tkankowego lub strzykawki) różni się w zależności od linii komórkowych. Zacznij od 5 uderzeń
          a następnie sprawdź lizę pod mikroskopem. Liza powinna wynosić 80-90%. Jeśli liza nie jest wystarczająca, wykonaj kilka kolejnych uderzeń, aż do uzyskania całkowitej lizy.
         - Lizę można zaobserwować poprzez dodanie roztworu błękitu trypanu do odpowiedniej ilości komórek. Barwnik jest wykluczany z nienaruszonych
          komórek, ale barwi jądra lizowanych komórek. Jeśli widoczna jest liza jądrowa lub skupiska jąder, lub jeśli obserwowana jest galaretowata masa, rozbicie komórek mogło być zbyt energiczne lub wykonano zbyt wiele uderzeń.
12. Wiruj rozbite komórki w zawiesinie przez 20 minut z prędkością 10 000-11 000 x g.
13. Przenieś supernatant do świeżej probówki. Ta frakcja jest frakcją cytoplazmatyczną.
14. Dodaj 1,5 µl 0,1 M roztworu DTT i 1,5 µl koktajlu inhibitora proteazy do 147 µl buforu ekstrakcyjnego.
15. Zawiesić osad surowych jąder w ~140 µl (2/3X PCV) buforu ekstrakcyjnego zawierającego DTT i inhibitory proteazy. Jeśli procedura jest wykonywana za pomocą homogenizatora tkankowego, zaleca się wykonanie jeszcze 10 uderzeń w tym momencie.
16. Delikatnie wstrząsać przez 30 minut.
17. Wirować przez 5 minut z prędkością 20 000-21 000 x g.
18. Przenieść supernatant do czystej, schłodzonej probówki.
19. Kontynuować dializę lub przechowywać w temperaturze -70 °C.

Ekstrakcja z tkanki

Poniższa procedura dotyczy ekstrakcji białek jądrowych ze 100 mg tkanki.

1. Przygotuj świeży roztwór 0,1M DTT z ultraczystą sterylną wodą.
2. Przygotuj Bufor do Lizy
       a. Przygotować świeży roztwór 0,1M DTT z ultraczystą sterylną wodą.
       b. Przygotować bufor lizujący:
           - hipotoniczny: 10 mM HEPES, pH 7,9, z 1.5 mM MgCl₂ i 10 mM KCl.
            - izotoniczny (lub ekstrakcja białek z kruchych komórek): 10 mM Tris HCl, pH 7,5, z 2 mM MgCl₂, 3 mM CaCl₂, 0,3 M Sacharozy. 
      c. Do 1400 µL buforu lizującego (hipotonicznego lub izotonicznego) dodać 14 µL 0,1 M roztworu DTT i 14 µL koktajlu inhibitora proteazy.
   Uwaga: W przypadku testowanych tkanek bufor hipotoniczny działał lepiej niż izotoniczny. Jeśli tkanka okaże się zbyt delikatna, można użyć izotonicznego buforu lizującego.
3. Przygotuj bufor ekstrakcyjny
       a. Przygotować bufor ekstrakcyjny: 20 mM HEPES, pH 7,9, z 1,5 mM MgCl₂, 0,42 M NaCl, 0,2 mM EDTA, 25% (v/v) Glicerol.
       b. Dodać 1,5 µL przygotowanego 0,1 M roztworu DTT i 1,5 µL koktajlu inhibitora proteazy do 147 µL buforu ekstrakcyjnego.
4. Płukać tkankę dwukrotnie buforem PBS. Wyrzucić PBS.
5. Zawiesić delikatnie tkankę w 1 ml (5X PCV) buforu lizującego zawierającego DTT i inhibitory proteazy.
6. Homogenizować tkankę (używając homogenizatora tkankowego), aż ponad 90% komórek zostanie rozbitych, a jądra zostaną uwidocznione pod mikroskopem.
7. Wiruj rozbite komórki przez 20 minut z prędkością 10 000-11 000 x g.
8. Przenieś supernatant do świeżej probówki. Ta frakcja jest frakcją cytoplazmatyczną.
9. Zawiesić surowy osad jąder w ~140 µL (2/3X PCV) buforu ekstrakcyjnego zawierającego DTT i inhibitor proteazy. Na tym etapie można przeprowadzić krótką homogenizację w celu ułatwienia ekstrakcji jądra.
10. Delikatnie wstrząsać przez 30 minut.
11. Wirować przez 5 minut z prędkością 20 000 - 21 000 x g.
12. Przenieść supernatant do czystej, schłodzonej probówki.
13. Kontynuować dializę lub przechowywać w temperaturze -70 °C.

Dializa

Przed wykonaniem procedury etykietowania ważne jest doprowadzenie ekstraktu do wymaganego pH poprzez dializę.

1. Przygotować 0,1M, pH 9,5-9,6, bufor węglanowo-wodorowęglanowy (rozpuścić 2 kapsułki produktu nr  C3041 w 100 ml wody).
2. Dializować w temperaturze 4 °C przez 2 godziny w buforze dializacyjnym o objętości 1000 razy większej niż objętość ekstraktu białka jądrowego.
3. Zmienić bufor dializacyjny na świeżo przygotowany bufor węglanowy i dializować przez dodatkowe 2 godziny w temperaturze 4 °C. Oznaczyć stężenie białka zgodnie z procedurą Bradford.