Prosta i skuteczna ekstrakcja białek z hepatocytów za pomocą odczynnika CytoBuster
Cytochromy p450 (CYP) to duża grupa monooksygenaz zawierających hem, które katalizują wiele ważnych funkcji biologicznych (1). Obejmują one w szczególności oksydacyjną konwersję wielu steroidów, lipidów, toksyn środowiskowych i ksenobiotyków. Ta rodzina enzymów odgrywa znaczącą rolę w biotransformacji leków, ma szeroką specyficzność substratową, a ekspresja jest indukowana w odpowiedzi na wiele powszechnie stosowanych związków (2-5). W poszukiwaniu nowych farmaceutyków wiele czynników decyduje o sukcesie związków wiodących. Wpływ tych związków na poziomy ekspresji białek CYP jest cenną informacją do przewidywania możliwych interakcji lekowych i może pomóc w określeniu ich potencjału jako leków rynkowych.
Analiza białek CYP
Zachodnia analiza CYP w izolowanych hepatocytach jest użytecznym narzędziem do wykrywania zmian w poziomach CYP. Komórki muszą zostać poddane lizie, aby uwolnić te i wiele innych zawartych w nich białek. Istnieje kilka protokołów przygotowania białek, które obejmują rozerwanie detergentem (dodecylosiarczan sodu; SDS), mechaniczne rozerwanie (homogenizator Dounce'a) i ekstrakcję fenolem.
Próbki przygotowane w buforach opartych na SDS powodują całkowitą lizę komórek, ale wysoka lepkość (z powodu uwolnienia chromosomalnego DNA) jest często problemem podczas ładowania próbek na żel. Silne zakłócenia mechaniczne, takie jak sonikacja lub przepuszczanie próbek przez igłę podskórną, są często stosowane w celu przezwyciężenia często napotykanej "lepkości". Zaobserwowano pewną degradację białka w obu tych metodach, co skutkowało rozmazaniem pasma na immunoblocie. Mechaniczne rozbijanie, choć skuteczne, generalnie skutkuje większymi objętościami rozcieńczonej próbki, co jest niewygodne, gdy objętość próbki nie może przekraczać 20-50 μl. Ekstrakcja fenolem może skutkować wysoką wydajnością białka, ale może być czasochłonna, a same odczynniki są nieprzyjemne w użyciu.
CytoBuster™ Protein Extraction Reagent to zastrzeżona formuła detergentów przygotowana do wydajnej ekstrakcji rozpuszczalnych białek z komórek ssaków. CytoBuster umożliwia izolację funkcjonalnie aktywnych białek bez potrzeby wtórnej obróbki, takiej jak sonikacja. Zapewnia prostą, szybką i tanią alternatywę dla wcześniej omówionych metod.
Przygotowanie ekstraktu i analiza Western
Hepatocyty szczura (250 000 komórek) osuszono i przemyto w 1X PBS. Dodano odczynnik CytoBuster™ (50 μl) i ponownie zawieszono komórki. Próbki inkubowano na lodzie przez 15 minut, a nierozpuszczalne resztki komórek poddano granulacji przy 16 000 -g przez 2 minuty. Rozpuszczalną frakcję supernatantu przeniesiono do świeżej probówki, a nierozpuszczalne granulki odrzucono.
Ekstrakcje w sposób powtarzalny dawały od 15 do 25 mg/ml białka, jak zmierzono przy użyciu testu Bio-Rad DC Protein Assay.Uwaga redaktora: Odczynnik CytoBuster jest kompatybilny z wieloma standardowymi metodami oznaczania białek.
Rys. 1 przedstawia Western blot ekstraktu hepatocytów przygotowanego przy użyciu odczynnika CytoBuster. CYP3A2 wykryto przy użyciu przeciwciała poliklonalnego z drugorzędowym przeciwciałem sprzężonym z fosfatazą alkaliczną. Markery zachodnie Trail Mix™ firmy Novagen zostały umieszczone na sąsiednim pasie i uwidocznione wraz z CYP3A2 poprzez włączenie koniugatu AP białka S do inkubacji z przeciwciałem drugorzędowym. Blot pokazuje silne pasmo reagujące z przeciwciałem o oczekiwanej wielkości dla CYP3A2, co wskazuje, że białko docelowe zostało skutecznie wyekstrahowane za pomocą odczynnika CytoBuster. Obecnie rutynowo używamy CytoBuster do przygotowywania ekstraktów z różnych linii komórkowych.
![Simple, efficient extraction of protein from hepatocytes with CytoBuster™ Reagent Przygotowanie ekstraktu i analiza Western](/deepweb/assets/sigmaaldrich/marketing/global/images/technical-documents/articles/protein-biology/protein-lysis-and-extraction/western-blot-analysis/western-blot-analysis.jpg)
Rysunek 1.Analiza Western blot wykazująca obecność białka CYP3A2 w hepatocytach szczura Hepatocyty szczura (komórki 250K) poddano lizie przy użyciu odczynnika do ekstrakcji białek CytoBuster, jak opisano w tekście. Próbkę białka o masie 5 μg mieszano bezpośrednio z taką samą objętością buforu do próbek SDS (250 mM Tris-HCl pH 6,8, 10% glicerol, 0,01% błękit bromofenolowy, 100 mM DTT) i ładowano na 9% żel SDS-PAGE. Białka przeniesiono na membranę PVDF, a Western blot wysondowano kozim przeciwciałem poliklonalnym anty-CYP3A2, a następnie drugorzędowym przeciwciałem sprzężonym z AP. Markery Trail Mix Western wykrywano na sąsiednim pasie przez dodanie koniugatu AP białka S (Novagen) do inkubacji z przeciwciałem drugorzędowym. Wykrywanie chromogenne przeprowadzono przy użyciu substratów NBT/BCIP (Novagen). M, markery; 1, próbka hepatocytów; 2, tylko CytoBuster.
Podsumowanie
CytoBuster Protein Extraction Reagent to przyjazny dla użytkownika system do powtarzalnej analizy białek CYP. Obecnie możliwa jest skuteczna i szybka ekstrakcja rozpuszczalnych białek z komórek ssaków do analizy CYP bez narażania ich na trudne warunki często związane z obróbką wtórną, taką jak sonikacja.
Zalety wykazane niezależnie i w tych eksperymentach obejmują:
- Szybkość i zmniejszona obsługa skutkują mniejszą degradacją białek.
- Znaczna redukcja lepkości w stosunku do innych metod sprawia, że próbki są łatwe do załadowania na żel SDS-PAGE, zmniejszając zmienność często obserwowaną w tej technice.
Białka są skutecznie ekstrahowane w powtarzalnym, wysokim stężeniu. Ponadto ekstrakt jest kompatybilny z testem białkowym preferowanym przez laboratorium. Odczynnik CytoBuster Protein Extraction Reagent stanowi znacznie ulepszoną metodę ekstrakcji białek.
Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.
Nie masz konta użytkownika?