Procedura immunohistochemiczna dla tkanek zatopionych w parafinie

Rysunek 1. Barwienie immunohistochemiczne

Technika immunohistochemiczna

Barwienie immunohistochemiczne jest cennym narzędziem do wykrywania specyficznych antygenów w tkankach. Aby wykonać standardową procedurę barwienia, najpierw wycinek tkanki musi zostać odparafinowany, a następnie ponownie uwodniony przed nałożeniem pierwotnego przeciwciała. Następnie stosuje się przeciwciała drugorzędowe sprzężone z enzymem, a specyficzne barwienie można uwidocznić po dodaniu substratu specyficznego dla enzymu. Czasami, gdy obserwuje się słabe zabarwienie lub jego brak, może być wymagane "demaskowanie" antygenu poprzez trawienie enzymatyczne.

Poniższa procedura opisuje zastosowanie koniugatów peroksydazy lub fosfatazy alkalicznej w znakowaniu immunohistochemicznym utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie skrawków tkanek.

Odczynniki i sprzęt

Wiele z tych produktów można znaleźć w tabeli materiałów poniżej.

1. Utrwalone w formalinie, zatopione w parafinie skrawki tkanek
2. 0,01 M sól fizjologiczna buforowana fosforanem, pH 7,4 (PBS) (Nr produktu. P3813 lub  P4417-tabletka)
3. Albumina surowicy bydlęcej (BSA) (Nr produktu. A9647)
4. Diluent: 1% BSA w PBS (Nr produktu  P3688)
5. ksylen (Nr produktu  247642, lub Nr produktu. 534056)
6. Etanol absolutny (Nr produktu  32221, tylko Europa, lub Nr produktu. E7023)
7. 0,1% trypsyna (Product No. T7409) w PBS lub tabletka trypsyny (Product No. T7168) w 4 mM CaCl2, 200 mm Tris, pH 7,7 lub 0,1% proteazy (nr produktu. P5380) w PBS.
8. Mikrofalowy roztwór do odzyskiwania antygenu: 10 mM cytrynian sodu (Product No. C8532) bufor pH 6.0, 1 mM EDTA (Product No. ED4SS) pH 8.0
9. Przeciwciało pierwszorzędowe
10. Opcja 1: Biotynylowane przeciwciało drugorzędowe i ExtrAvidin-Peroxidase (Product No.E2886) lub ExtrAvidin-Alkaline Phosphatase (E2636), lub Opcja 2: Przeciwciało drugorzędowe sprzężone z peroksydazą lub fosfatazą alkaliczną
11. W przypadku stosowania przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z peroksydazą lub ExtrAvidin-Peroxidase: 3% nadtlenek wodoru (w wodzie dejonizowanej, świeżo przygotowany z 30% zapasu).
12. Substrat enzymatyczny: w zależności od enzymu i potrzebnego koloru (patrz  Substraty).
13. Dla peroksydazy: AEC Staining Kit (Product No. AEC101), DAB (Product No. D4418 lub  D0426).
14. Dla fosfatazy alkalicznej: Fast Red TR/Naphtol AS-MX (Nr produktu  B5655).
15. Hematoksylina Mayera (Nr produktu  MHS1)
16. Słoiki do barwienia Coplin (Nr produktu. S5641)
17. Mikrofalówka
18. Mikroskop

.Kroki protokołu IHC

1. Przygotowanie slajdu
2. Pierwotna reakcja przeciwciał
3. Drugorzędowa reakcja przeciwciał
4. Przygotowanie substratu
5. Rozwój
6. Barwienie

Przygotowanie szkiełka

• Deparafinizacja i nawodnienie
• Odzyskiwanie antygenu - demaskowanie
• Inaktywacja endogennej peroksydazy
  

Deparaffinization and Rehydration

1. Place the slides in a 56-60 °C oven for 15 min. (Uwaga: Temperatura piekarnika nie może przekraczać 60°C).
2. Przenieś do kąpieli ksylenowej i wykonaj dwie zmiany ksylenu przez 5 minut każda.
3. Wytrząśnij nadmiar płynu i nawadniaj szkiełka w dwóch zmianach świeżego absolutnego etanolu przez 3 minuty każda.
4. Wytrząśnij nadmiar płynu i umieść szkiełka w świeżym 90% etanolu na 3 minuty.
5. Otrząśnij nadmiar płynu i umieść szkiełka w świeżym 80% etanolu na 3 minuty.
6. Płucz szkiełka w delikatnie bieżącej wodzie z kranu przez 30 sekund (unikaj bezpośredniego strumienia, który może zmyć lub poluzować sekcję).
7. Umieść w kąpieli płuczącej PBS w celu dalszej rehydratacji (30 min. w temperaturze pokojowej).

Odzyskiwanie antygenu - demaskowanie antygenu

Uwaga: Ten krok jest wykonywany tylko w przypadkach, gdy występuje słabe barwienie lub jego brak, lub w przypadku antygenów wymagających "demaskowania" zgodnie ze specyfikacją pierwotnego przeciwciała.

Istnieje kilka możliwych sposobów odzyskiwania w zależności od przeciwciała i antygenu:

Odzyskiwanie enzymatyczne:

1. Zastosuj 0,1% trypsynę w PBS lub 0,1% proteazę w PBS przez 2-30 min. w 37 °C. Przedłużenie czasu inkubacji może spowodować wydłużenie czasu inkubacji. Wydłużenie czasu inkubacji może również poprawić specyficzne barwienie. Płukać w PBS przez 10 min.

Wybieranie mikrofalowe:

1. Umyć szkiełka dejonizowaną H2O i umieścić je w odpornym na mikrofale plastikowym słoiku do barwienia zawierającym roztwór do pobierania antygenu. Upewnij się, że szkiełka są całkowicie pokryte roztworem.
2. Uruchom kuchenkę mikrofalową na 5 minut na wysokiej mocy (~700 watów). Upewnij się, że szkiełka są nadal pokryte roztworem lub dodaj świeży roztwór i powtórz mikrofalowanie.
3. Proces ten można powtórzyć 2-3 razy.
4. Pozostaw do powolnego ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez co najmniej 20 minut przed przejściem do następnego kroku.

Inaktywacja endogennej peroksydazy

Uwaga: Ten krok jest wykonywany tylko w przypadku stosowania przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z peroksydazą lub peroksydazą ExtrAvidin.

1. Umieść szkiełka na płaskiej, równej powierzchni. Nie pozwól, aby szkiełka dotykały się nawzajem. Nie dopuść do wyschnięcia skrawków w żadnym momencie.
2. Dodaj wystarczającą ilość kropli 3% nadtlenku wodoru, aby pokryć cały skrawek.
3. Inkubuj 5 min. w temperaturze pokojowej.
4. Płukać PBS z butelki do płukania.
5. Umieścić szkiełko w łaźni do płukania PBS na 2 minuty.

Pierwotna reakcja przeciwciał

Uwaga:

a. Wstępna inkubacja próbki z 5% BSA przez 10 minut przed reakcją z przeciwciałem pierwotnym może zmniejszyć barwienie tła. Aby uzyskać najlepsze wyniki z tkankami zwierzęcymi, należy użyć od 5 do 10% normalnej surowicy z tego samego gatunku, co gospodarz przeciwciała wtórnego.
b. Optymalne rozcieńczenie i czas inkubacji należy określić dla każdego przeciwciała pierwotnego przed użyciem.

1. Pozwolić szkiełkom ocieknąć, strząsnąć nadmiar płynu energicznym ruchem i ostrożnie wytrzeć każde szkiełko wokół skrawków.
2. Rozcieńczyć przeciwciało pierwotne lub odczynnik kontroli ujemnej do optymalnego rozcieńczenia w rozcieńczalniku. Sam rozcieńczalnik może być użyty jako kontrola negatywna. Należy również wykonać szkiełko kontroli pozytywnej (tkanka, o której wiadomo, że zawiera badany antygen).
3. Nałożyć 100 µL roztworu przeciwciała pierwotnego na odpowiednie szkiełka, przykrywając skrawki tkanki.
4. Przechylić każde szkiełko w dwóch różnych kierunkach, tak aby płyn był równomiernie rozprowadzony na szkiełku.
5. Inkubować przez co najmniej 60 minut w temperaturze 37 °C w nawilżonej komorze. Dłuższa inkubacja jest zalecana w przypadku antygenów o niskiej gęstości.
6. Delikatnie spłucz PBS z butelki do płukania. Umieść szkiełko w łaźni do płukania PBS na 5 minut.

Reakcja z przeciwciałem wtórnym

• Opcja 1 - Wykrywanie biotyny/ExtrAvidin
• Opcja 2 - Przeciwciało drugorzędowe znakowane enzymem

.Opcja 1 - Wykrywanie biotyny/ekstrAwidyny

1. Pozwól szkiełkom ocieknąć, strząśnij nadmiar płynu i ostrożnie wytrzyj szkiełko jak poprzednio.
2. Rozcieńczyć biotynylowane przeciwciało drugorzędowe w rozcieńczalniku do jego optymalnego stężenia.
3. Nałożyć 100 µL na każdy szkiełko, pokrywając skrawki tkanki.
4. Przechylić każde szkiełko w dwóch różnych kierunkach.
5. Inkubować w komorze wilgotnościowej przez co najmniej 30 min. w temperaturze pokojowej.
6. Delikatnie spłukać PBS z butelki do płukania.
7. Umieścić szkiełko w łaźni do płukania PBS na 5 minut.

Reakcja ExtrAvidin

1. Pozwolić szkiełkom ocieknąć. Strząśnij nadmiar płynu i ostrożnie wytrzyj szkiełko jak poprzednio.
2. Rozcieńcz peroksydazę ExtrAvidin lub fosfatazę alkaliczną ExtrAvidin w rozcieńczalniku do optymalnego stężenia.
3. Nałożyć 100 µL na wszystkie szkiełka; przykryć sekcję.
4. Przechylić każde szkiełko w dwóch różnych kierunkach.
5. Inkubować w nawilżonej komorze przez co najmniej 20 minut w temperaturze pokojowej.
6. Delikatnie spłucz PBS z butelki do płukania.
7. Umieść szkiełko w kąpieli płuczącej PBS na 5 minut.
8. Przejdź do kroku "Przygotowanie i opracowanie podłoża".

Opcja 2 - Przeciwciało drugorzędowe znakowane enzymem

1. Pozwolić szkiełku ocieknąć. Strząśnij nadmiar płynu energicznym ruchem i ostrożnie wytrzyj szkiełko jak poprzednio.
2. Rozcieńcz przeciwciało wtórne sprzężone z peroksydazą lub fosfatazą alkaliczną w rozcieńczalniku do optymalnego rozcieńczenia.
3. Nałóż 100 µL na wszystkie szkiełka, pokrywając skrawki tkanek.
4. Przechyl każdy szkiełko w dwóch różnych kierunkach.
5. Inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 37°C w nawilżonej komorze.
6. Delikatnie spłucz PBS z butelki do płukania.
7. Umieść szkiełka w łaźni do płukania PBS na 5 minut.

Przygotowanie substratu

Zaleca się przygotowanie mieszaniny substratów podczas ostatniego etapu płukania.

Uwaga: Dodanie 1 mM lewamizolu (Nr produktu. L9756) do roztworu substratu fosfatazy alkalicznej w znacznym stopniu zahamuje aktywność endogennej fosfatazy alkalicznej (z wyjątkiem izoenzymu jelitowego)./p>

Rozwój

1. Pozwolić każdemu szkiełku osączyć się. Strząśnij nadmiar płynu i ostrożnie wytrzyj szkiełko jak poprzednio.
2. Nałóż wystarczającą ilość kropli świeżo przygotowanej mieszaniny substratów, aby pokryć fragment tkanki.
3. Inkubuj 5-10 min. lub do momentu zaobserwowania pożądanej reakcji barwnej podczas monitorowania pod mikroskopem. Zakończ reakcję przed pojawieniem się barwienia tła w kontrolach negatywnych, delikatnie spłukując wodą destylowaną z butelki do płukania.

Barwienie przeciwne

Uwaga: W przypadku stosowania substratu AEC nie należy używać roztworów zawierających alkohol do barwienia przeciwnego (np.g., Hematoksylina Harrisa, kwaśny alkohol), ponieważ plama AEC utworzona tą metodą jest rozpuszczalna w rozpuszczalnikach organicznych. Szkiełka nie wolno odwadniać, przenosić z powrotem do toluenu (lub ksylenu) ani montować w preparatach zawierających toluen.

1. Nałóż wystarczającą ilość hematoksyliny Mayera, aby pokryć sekcję lub umieść szkiełko w kąpieli z hematoksyliną Mayera.
2. Inubuj przez 0,5-5 min, w zależności od mocy użytej hematoksyliny.
3. Delikatnie przepłucz szkiełko wodą destylowaną z butelki do płukania.
4. Płucz szkiełko pod delikatnie bieżącą wodą z kranu przez 5 minut (unikaj bezpośredniego strumienia, który może zmyć lub poluzować sekcję).
5. Montuj sekcje przy użyciu wodnego podłoża montażowego, takiego jak żelatyna glicerolowa. Szkiełko nakrywkowe może być zabezpieczone bezbarwnym lakierem do paznokci.

Referencje

1. Cuello A. 1993. Immunohistochemistry II. 1. Wiley.