Test enzymatyczny lizozymu (EC 3.2.1.17)

• Środki ostrożności
• Wymagane odczynniki i sprzęt
• Instrukcja przygotowania
• Procedura
• Wyniki

Ta procedura może być stosowana do enzymatycznego oznaczania produktów lizozymu. Spektrofotometryczne oznaczanie szybkości (A₄₅₀, ścieżka światła = 1 cm) opiera się na następującej reakcji:

Lizozym

Micrococcus lysodeikticus Cells (Intact)  -------->  Micrococcus lysodeikticus Cells (Lysed)

Unit Definition - One unit of Lysozyme will produce a ΔA₄₅₀ of 0.001 na minutę przy pH 6,24 w temperaturze 25 °C przy użyciu zawiesiny Micrococcus lysodeikticus jako substratu w mieszaninie reakcyjnej o objętości 2,6 ml.

Środki ostrożności

W celu uzyskania informacji dotyczących zagrożeń i bezpiecznego postępowania należy zapoznać się z kartą charakterystyki.

Wymagane odczynniki i sprzęt

1.0 M roztwór jednozasadowego fosforanu potasu (P8709)

1.0 M roztwór dwuzasadowy fosforanu potasu (P8584)

1 M roztwór wodorotlenku potasu (KOH)

1 M roztwór HCl

Micrococcus lysodeikticus, ATCC No. 4698, komórki liofilizowane (M3770)

Instrukcja przygotowania

Do przygotowania odczynników należy używać ultraczystej wody (oporność ≥18 MΩxcm w temperaturze 25 °C).

Bufor (50 mM bufor fosforanu potasu, pH 6.24, w 25 °C) - Do przygotowanych 550 ml:

• Dodaj 20,125 ml 1,0 M jednozasadowego roztworu fosforanu potasu (P8709).
• Dodaj 7,375 ml 1,0 M dwuzasadowego roztworu fosforanu potasu (P8584).
• Dodaj ultraczystą wodę, aby uzupełnić końcową objętość do 550 ml.
• Dostosuj pH do 6,24 w 25 ° C za pomocą 1 M KOH lub 1 M HCl.

Zawiesina substratu (0,015% [w/v] Micrococcus lysodeikticus zawiesina komórek) - Przygotuj 0.15 mg/ml zawiesiny w buforze przy użyciu liofilizowanych komórek Micrococcus lysodeikticus, ATCC nr 4698 (M3770).

Przydatność podłoża - A₄₅₀ tej zawiesiny musi wynosić między 0,6-0,7 w stosunku do ślepej próby buforu. W razie potrzeby dostosuj absorbancję, używając odpowiedniej ilości buforu lub komórek Micrococcus lysodeikticus .

Roztwór enzymu (lizozymu) - Bezpośrednio przed użyciem przygotować roztwór zawierający 200-400 jednostek/ml lizozymu w zimnym (2-8 °C) buforze.

Procedura

1. Odmierzyć pipetą następujący odczynnik do odpowiednich kuwet i wyrównać temperaturę do 25 °C za pomocą odpowiednio termostatowanego spektrofotometru:

Odczynnik	Puste miejsce (mL)	Test 1 (mL)	Test 2 (mL)	Test 3 (mL)
Zawiesina substratu	2.50	2.50	2.50	2.50

2. Następnie dodaj:

Odczynnik	Puste (mL)	Test 1 (mL)	Test 2 (mL)	Test 3 (mL)
Bufor	0.10	-	-	-
Roztwór enzymatyczny	-	0.10	0.10	0.10

3. Natychmiast wymieszać przez odwrócenie i rejestrować spadek A₄₅₀ przez 5 minut. Uzyskać maksymalną szybkość liniową (ΔA₄₅₀/minutę) dla wszystkich testów i ślepej próby, stosując co najmniej jednominutowy odstęp i co najmniej 4 punkty danych.

Wyniki

Obliczenia

1.

gdzie:

df = współczynnik rozcieńczenia

0,001 = zmiana absorbancji (ΔA₄₅₀) zgodnie z definicją jednostki

0.1 = objętość (w mililitrach) roztworu enzymu

2.      

Odniesienie

1. Shugar D. 1952. The measurement of lysozyme activity and the ultra-violet inactivation of lysozyme. Biochimica et Biophysica Acta. 8302-309. https://doi.org/10.1016/0006-3002(52)90045-0