Test enzymatyczny elastazy (EC 3.4.21.36)

Przegląd sekcji

• Opis
• Środki ostrożności
• Wymagane odczynniki i sprzęt
• Instrukcje przygotowania
• Procedura
• Wyniki
• Powiązane produkty

Opis

Ta procedura może być stosowana do produktów elastazy przy użyciu SucAla₃-pNA jako substratu.

Ciągłe spektrofotometryczne oznaczanie szybkości (A₄₁₀, droga światła = 1 cm) opiera się na następującej reakcji:

gdzie:
SucAla₃-pNA = N-Succinyl-Ala-Ala-p-nitroanilid
SucAla₃ = N-Succinyl-Ala-Ala-Ala
pNA = p-Nitroanilide

Unit Definition - One unit of Elastase will hydrolyze 1.0 µmoli N-sukcynylo-L-Ala-Ala-p-nitroanilidu na minutę przy pH 8.0 w temperaturze 25 °C.

Środki ostrożności

W celu uzyskania informacji dotyczących zagrożeń i bezpiecznego postępowania należy zapoznać się z kartą charakterystyki.

Wymagane odczynniki i sprzęt

Trizma^® base (Product No. T1503)
N-Succinyl-Ala-Ala-p-nitroanilide (Product No. S4760)

.Instrukcje przygotowania

Do przygotowania odczynników należy używać ultraczystej wody (oporność ≥18 MΩxcm w temperaturze 25 °C).

Bufor (100 mM Tris HCl, pH 8,0 w 25 °C) - Przygotuj 12,1 mg/ml roztworu Trizma^® base (Product No. T1503) w wodzie ultraczystej. Dostosuj pH do 8,0 w 25 °C za pomocą 1 M HCl.

Roztwór substratu (4.4 mM roztwór SucAla₃-pNA) - Przygotuj 2 mg/ml roztworu  N-Succinyl-Ala-Ala-p-nitroanilidu  (Nr produktu. S4760) w buforze.

Roztwór enzymu (elastazy) - Bezpośrednio przed użyciem przygotować roztwór zawierający 0,2-0.5 jednostek/ml elastazy w zimnym (2-8°C) buforze.

Procedura

W 3,00 ml mieszaniny reakcyjnej, końcowe stężenia wynoszą 96,7 mM Trizma^®, 0.29 mM N-sukcynylo-Ala-Ala-p-nitroanilidu i 0,02-0,05 jednostki elastazy.

1.     Odpipetuj następujące odczynniki do odpowiednich kuwet:

Odczynnik	Test (mL)	Blank (mL)
Bufor	2.70	2.80
Roztwór substratu	0.20	0.20

2.     Wymieszać przez odwrócenie i wyrównać do 25 °C. Następnie dodać:

Odczynnik	Test (mL)	Puste (mL)
Roztwór enzymu	0.10	-

3. Natychmiast wymieszać przez odwrócenie i rejestrować wzrost A₄₁₀ przez ~5 minut. Uzyskaj ΔA₄₁₀/minutę, używając maksymalnej szybkości liniowej zarówno dla testu, jak i ślepej próby, używając co najmniej 4 punktów danych w jednominutowym przedziale czasu.

Wyniki

Obliczenia

.

1.

Jednostki/mL enzymu =	(ΔA410/min Test - ΔA410/min Blank) (3.00) (df)
	(8.8) (0.10)

gdzie:
3,00 = całkowita objętość (mL) testu
df = współczynnik rozcieńczenia
8.8 = milimolarny współczynnik ekstynkcji p nitroaniliny przy 410 nM przy pH 8,0
0,1 = objętość (mL) użytego roztworu enzymu

2.

Units/mg solid =	jednostki/mL enzymu
	mg stałego/mL enzymu

Referencje

1. Bieth J, Spiess B, Wermuth CG. 1974. The synthesis and analytical use of a highly sensitive and convenient substrate of elastase. Biochemical Medicine. 11(4):350-357. https://doi.org/10.1016/0006-2944(74)90134-3