Test enzymatyczny celulazy

1. Cel

Standaryzacja procedury oznaczania enzymatycznego celulazy.

2. Zakres

Niniejsza procedura ma zastosowanie do wszystkich produktów celulazy i hemicelulazy.

3. Definicje

3.1 Metoda: Spektrofotometryczne oznaczanie szybkości zatrzymania

3.2 Warunki: T = 37 °C, pH = 5,0, Abs340nm, Droga światła = 1 cm

3.3 ATP = Adenozyno-5'-Trifosforan

3.4 ADP = Adenozyno-5'-Difosforan

3.5 β-NAD = Dinukleotyd β-Nikotynamidoadeninowy, forma utleniona

3.6 β-NADH = Dinukleotyd β-Nikotynamidoadeninowy, forma zredukowana

3.7 G-6PDH = Dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa

3.8 G-PG = 6-fosfo-D-glukonian

3.9 Celuloza + H2O Celulaza> D-Glukoza

3.10 D-glukoza + ATP heksokinaza> 6-fosforan D-glukozy + ADP

3.11 6-fosforan D-glukozy + β-NAD G-6PDH> 6-PG + β-NADH

3.12 Definicja jednostki: Jedna jednostka uwalnia 1,0 μmola glukozy z celulozy w ciągu jednej godziny przy pH 5,0 w temperaturze 37 °C (czas inkubacji 2 godziny).

3.13 Końcowe stężenie testu: W mieszaninie reakcyjnej o objętości 5,00 ml końcowe stężenia wynoszą 40 mM octanu sodu, 4% (w/v) Sigmacell i 2-6 jednostek celulazy.

4. Dyskusja

N/A

5. Obowiązki

Odpowiedzialność za przestrzeganie niniejszej procedury zgodnie z jej zapisami spoczywa na przeszkolonym personelu działu usług analitycznych, wsparcia nowych produktów oraz badań i rozwoju.

6. Bezpieczeństwo

Odniesienie do kart charakterystyki substancji niebezpiecznych (SDS) w celu zapoznania się z zagrożeniami i odpowiednimi środkami ostrożności dotyczącymi postępowania.

7. Procedura

7.1 Odczynniki

Numer produktu	Opis
S8625.	Octan sodu, trihydrat
H3162	1 N kwas solny
S3504	Sigmacell Microcrystalline Type 20
G3293	Odczynnik do oznaczania glukozy (HK)

7.2 Materiały/sprzęt

Jednorazowe, wykonane ze szkła borokrzemowego, probówki hodowlane

Pipety i końcówki o regulowanej objętości

Waga

Vortex

Łaźnia z wytrząsarką

Piekarnik 37 ºC

Spektrofotometr

Kuwety do spektrofotometru

Wirówka

7.3 Powiązane procedury operacyjne

N/A

7.4 Przygotowanie roztworu

7.4.1  50 mM bufor octanu sodu, pH 5.0 w temperaturze 37°C

7.4.1.1  Przygotować 200 ml w wodzie dejonizowanej przy użyciu 1,36 g octanu sodu, trihydratu, nr prod. Nr S8625. Doprowadzić do pH 5,0 w temperaturze 37°C za pomocą 1N HCl, nr prod. Nr H3162.

7.4.2  5% (w/v) Sigmacell Solution (Sigmacell)

7.4.2.1    Przygotować 100 ml w 50 mM buforze octanu sodu, używając 5 g mikrokrystalicznego roztworu Sigmacell typu 20, nr prod. Nr S3504. Wymieszać i delikatnie podgrzać do uzyskania jednorodnej zawiesiny.

7.4.3  Fiolka do oznaczania glukozy (HK)

7.4.3.1  Użyć odczynnika do oznaczania glukozy (HK), nr prod. Nr G3293. Zawartość rozpuścić zgodnie z instrukcjami na etykiecie.

7.4.4  Roztwór enzymu celulazy (celulaza)

7.4.4.1  Bezpośrednio przed użyciem przygotować roztwór zawierający 2-6 jednostek/ml celulazy w zimnej wodzie dejonizowanej.

7.5 METODA TESTOWA

7.5.1  Odmierzyć pipetą (w mililitrach) następujące ilości do jednorazowych probówek hodowlanych ze szkła borokrzemowego:

Odczynnik	Test	Blank
4.Odczynnik	Test	Puste
Sigmacell	4.00	4.00

7.5.1.1   Wyrównać do temperatury 37 °C.

7.5.1.2   Następnie dodać:

Odczynnik	Test	Blank
1.Odczynnik	Test	Puste
Cellulaza	1.00	----
Woda dejonizowana	----	1.00

7.5.1.3   Natychmiast wymieszać zarówno Test, jak i Próbę Ślepą przez wirowanie. Za pomocą łaźni z wytrząsarką inkubować zarówno Test, jak i Próbę Ślepą w temperaturze 37 °C przez dokładnie 120 minut z umiarkowanym wytrząsaniem.

7.5.1.4    Natychmiast przenieść zarówno Test, jak i Próbę Ślepą do łaźni z lodem. Odstawić, aż zawiesiny opadną. Wirować z prędkością około 4000 obr/min przez około 2 minuty w celu oczyszczenia. Użyj supernatantu w kroku 7.5.2.2.

7.5.2    Odmierz pipetą (w mililitrach) następujące ilości do odpowiednich kuwet:

Odczynnik	Test	Blank
Fiolka do oznaczania glukozy (HK)	3.00	3.00

7.5.2.1    Wyrównać do 25 °C. Monitorować A_340nm aż do uzyskania stałej wartości, używając odpowiednio termostatowanego spektrofotometru. Zapisz początkową wartość A_340nm zarówno dla testu, jak i próby ślepej.

7.5.2.2   Następnie dodaj:

Odczynnik	Test	Puste
Supernatant testowy (krok 7.5.1.4)	0.10	----
Blank Supernatant (krok 7.5.1.4)	----	0.10

7.5.2.3   Natychmiast wymieszać przez odwrócenie i rejestrować wzrost A_340nm aż do zakończenia (przez około 5 minut). Uzyskać końcową wartość A_340nm zarówno dla testu, jak i próby ślepej.

7.6 OBLICZENIA

7.6.1    ΔA_340nm Test = A_340nm Test końcowy - A_340nm Test początkowy

7.6.2    ΔA_340nm Blank = A_340nm Blank Final - A_340nm Blank Initial

7.6.

7.6.3	Jednostki/ml enzymu =	. (ΔA340nm Test - ΔA340nm Blank) (3.1) (5) (DF)
		(6.22) (2) (1) (0.1)

.

7.6.3.1    3.1 = Objętość końcowa (w mililitrach) etapu 7.5.2

7.6.3.2    5 = Całkowita objętość (w mililitrach) mieszaniny reakcyjnej etapu 7.5.1

7.6.3.3    DF = współczynnik rozcieńczenia

7.6.3.4    6.22 = milimolarny współczynnik ekstynkcji β-NADH przy 340 nm

7.6.3.5    2 = współczynnik konwersji z 2 godzin na 1 godzinę zgodnie z definicją jednostki

7.6.3.6    1 = Objętość (w mililitrach) celulazy użytej w kroku 7.5.1

7.6.3.7    0,1 = objętość (w mililitrach) z etapu 7.5.1 użyta w etapie 7.5.2

7.

7.6.3.8	Units/mg solid =	Units/mL enzyme
		mg stałego/ml enzymu

8. Odniesienia i załączniki

8.1 Załącznik: Formularz raportu

8.2 Referencje: Worthington, C.E. (1988) Worthington Enzyme Manual, pp76-79, Worthington Biochemical Corporation, Freehold, NJ

9. Zatwierdzenie

Przegląd, zatwierdzenia i podpisy dla tego dokumentu zostaną wygenerowane elektronicznie przy użyciu DocCompliance (QUMAS). Prosimy o wydrukowanie kopii "Do użytku", jeśli wymagana jest kopia papierowa z weryfikacją podpisu.