Proces chromatografii cienkowarstwowej
Przegląd sekcji
Zasada działania TLC
Co powoduje rozdzielenie rozpuszczonej mieszaniny po nałożeniu na płytkę TLC? Proces chromatografii cienkowarstwowej opiera się na siłach kapilarnych. Podczas opracowywania chromatogramu mieszanina substancji jest najpierw transportowana przez fazę ruchomą, a następnie przez chwilę przebywa na fazie stacjonarnej i jest ponownie przenoszona. Proces ten powtarza się wielokrotnie, a każda substancja jest spowalniana w różnym tempie w stosunku do prędkości fazy ruchomej. Im bardziej substancja preferencyjnie przebywa w fazie stacjonarnej, tym wolniejszy będzie jej postęp. Nawet substancje o podobnym powinowactwie do obu faz wykazują różnice w przebiegu chromatograficznym i można je rozdzielić. Oczywiście jest to uproszczone wyjaśnienie zasady działania TLC. Kontynuuj czytanie, aby odkryć dalsze szczegóły i praktyczne porady dotyczące procesu TLC.
Poznaj proces TLC
Poniższy schemat ilustruje kompletny proces chromatografii cienkowarstwowej.
Przygotowanie próbek
Płytki do chromatografii cienkowarstwowej są ekonomicznymi produktami jednorazowego użytku, więc przygotowanie próbek jest prostsze lub można go całkowicie uniknąć i jest przez to bardziej ekonomiczne niż w przypadku HPLC. Mimo to, w niektórych przypadkach, takich jak analiza śladowa lub w przypadku złożonych matryc, próbki będą wymagały oczyszczenia i/lub wzbogacenia przed nałożeniem na płytki.
Wstępne płukanie warstwy
Płytki szklane są zwykle pokryte sorbentami powierzchniowo czynnymi, które pochłaniają wilgoć i "brud" z powietrza. Te i wszelkie rozpuszczalne składniki spoiwa powinny zostać usunięte poprzez wstępne płukanie warstwy. Jest to wykonywane przez zanurzenie (raz lub dwa razy, 1-7 minut) lub przez ślepą chromatografię płytki TLC. Zanurzanie daje jednolitą warstwę, ale czyszczenie nie jest tak dokładne. Chromatografia ślepa trwa dłużej, ale jest bardziej skuteczna, ponieważ "brud" koncentruje się na górnej krawędzi płytki.
Wybór fazy stacjonarnej i ruchomej w procesie TLC
Faza stacjonarna
Faza stacjonarna TLC składa się z płytki TLC pokrytej warstwą sorbentu. Warstwy TLC można przygotować w laboratorium, ale zwykle są one kupowane jako wstępnie powlekane płytki. Dostępna jest szeroka gama opcji - od krzemionki, tlenku glinu lub celulozy, po płytki z warstwami modyfikowanymi lub mieszanymi. Wybór powinien opierać się na właściwościach próbki i celach aplikacji.
Podłoże płytek TLC jest zwykle wykonane ze szkła, aluminium lub tworzywa sztucznego, a każde z nich ma swoje specyficzne cechy. Płytki szklane są chemicznie obojętne i odporne na reaktywne plamy i ciepło, ale są kruche i trudne do cięcia. Płytki aluminiowe i plastikowe można ciąć nożyczkami, ale aluminium może nie tolerować silnie kwaśnych lub utleniających plam, a plastik nie przetrwa wysokich temperatur wymaganych do powstania wielu plam. Ponadto elastyczność płytek aluminiowych i plastikowych może powodować łuszczenie się warstwy sorbentu.
Faza ruchoma TLC (system rozpuszczalników)
Rozpuszczalnik rozpuszcza składniki próbki z warstwy sorbentu i przenosi je przez płytkę. Im silniej rozpuszczalnik jest adsorbowany przez sorbent, tym większa będzie jego siła elucyjna. Składniki próbki, które mają większe powinowactwo do rozpuszczalnika niż sorbent, będą eluowane bliżej przodu.
Rola układu rozpuszczalników w fazie ruchomej TLC:
- Rozpuścić mieszaninę substancji i przetransportować je przez warstwę sorbentu
- Przynieść wartości hRf jak najbliżej średniego zakresu
- Zapewnić odpowiednią selektywność dla mieszaniny substancji, która ma być rozdzielona
Wymagania układu rozpuszczalnika:
- Odpowiednia czystość
- Odpowiednia stabilność
- Niska lepkość
- Liniowy podział.li>Liniowa izoterma podziału
- Umiarkowana prężność par
- Najniższa możliwa toksyczność
Prekondycjonowanie warstwy
Bez podjęcia specjalnych środków ostrożności podczas aplikacji próbki, wilgotność w laboratorium może zmniejszyć aktywność warstwy TLC w ciągu kilku minut, gdy zostanie osiągnięta równowaga między atmosferą laboratorium a sorbentem. Wstępne kondycjonowanie płytki TLC pomaga uniknąć jej pogorszenia.
Nakładanie próbek
Próbki mogą być nakładane jako plamki lub pasma. Ogólnie rzecz biorąc, poszerzenie plamek w kierunku rozwoju jest mniej powszechne w przypadku aplikacji pasmowej niż w przypadku aplikacji punktowej. Polarność rozpuszczalnika jest kolejnym czynnikiem, który należy wziąć pod uwagę podczas nakładania próbki. Gdy używany jest n-heksan, substancje pozostają w punkcie aplikacji. Jednak w przypadku bardziej polarnych rozpuszczalników (toluen, dichlorometan, metanol) substancje są transportowane w kierunku krawędzi "strefy mokrej" i zazwyczaj tworzą chromatogram kołowy. Po rozwinięciu chromatograficznym uzyskuje się piki o prawie gaussowskim rozkładzie, których szerokość wzrasta wraz ze wzrostem polarności rozpuszczalnika (rysunek 1).
Rysunek 1.Rozkład substancji w TLC jako funkcja rozpuszczalnika.
Aplikacja ręczna
W zależności od liczby analizowanych próbek wybierz odpowiedni rozmiar płytki lub przytnij większą płytkę do wymaganych wymiarów. Za pomocą ołówka zaznacz żądane pozycje frontu i strefy aplikacji, rysując linie w poprzek płytki. Inne ważne informacje, takie jak numer roztworu i stężenie, powinny być również zapisane pod strefą nakładania. Uważaj, aby nie uszkodzić powierzchni warstwy, ponieważ może to prowadzić do błędów.
Możesz teraz umieścić punkt początkowy. Należy uważać, aby nie nałożyć próbki zbyt blisko dolnej krawędzi płytki, ponieważ może to spowodować rozprzestrzenienie się punktu początkowego w rozpuszczalniku. Objętość próbki zależy od celu analizy i stężenia roztworów próbki. Objętość próbki 0,5-2,0 µl jest zalecana do testów tożsamości, a maksymalnie 10 µl do testów czystości.
Aplikacja półautomatyczna
W aplikacji półautomatycznej stosuje się specjalny sprzęt do rozpylania roztworów próbek na płytkę. Metoda ta pozwala uniknąć bezpośredniego kontaktu z warstwą TLC i jest zwykle stosowana do aplikacji pasmowej.
W pełni automatyczna aplikacja
W pełni automatycznej aplikacji stalowa kapilara jest podłączona do strzykawki dozującej, która jest sterowana silnikiem krokowym. Próbki są nakładane ze stalowej kapilary jako pasma lub plamki
Chromatogram Development
W fazie rozwoju TLC, system rozpuszczalnika penetruje warstwę (z powodu sił kapilarnych, a czasami przy zastosowaniu ciśnienia) i transportuje próbkę wzdłuż warstwy. Interakcje między substancjami, układem rozpuszczalnika i warstwą TLC powodują rozdzielenie substancji na poszczególne składniki.
Suszenie płytek przed opracowaniem
Rozpuszczalnik użyty do nałożenia próbki musi zostać całkowicie usunięty przez wysuszenie płytek przed opracowaniem. Właściwości zastosowanych próbek i systemu rozpuszczalników są ważnymi czynnikami przy wyborze metody suszenia.
Metody rozwijania
Rozwijanie płytek TLC można osiągnąć za pomocą różnych technik, jak wymieniono poniżej.
- Rozwijanie jednowymiarowe
- a. Pojedyncze rozwijanie
- Pionowe
- Poziome, w jednym kierunku
- Poziome, w przeciwnych kierunkach
- Okrągłe
- Przeciwokrągłe
- b. Rozwijanie wielokrotne
- Oddzielne przebiegi na tym samym dystansie migracji
- Krokowo, rosnąco
- Krokowo, malejąco
- Automatyczny rozwój wielokrotny, stopniowy z gradientem rozpuszczalnika
- a. Pojedyncze rozwijanie
- Rozwój dwuwymiarowy
- a. Dwa wymiary, jeden układ rozpuszczalników
- b. Dwa wymiary, dwa układy rozpuszczalników
- c. SRS (rozdział w 1. wymiarze à reakcja chemiczna à rozdział w 2. wymiarze)
- Rozwój z wymuszonym przepływem
- a. OHLC: nadciśnieniowa chromatografia warstwowa
- b. HPPLC: wysokociśnieniowa planarna chromatografia cieczowa
- c. RPC: rotacyjna chromatografia planarna
Komory rozwojowe
Rozwój TLC jest zwykle przeprowadzany w komorach. W zależności od zastosowania i celów, dostępne są różne komory, różniące się materiałami i wynikami chromatograficznymi. Na przykład komory do chromatografii wstępującej są wykonane ze szkła i mają pokrywy ze szkła lub stali nierdzewnej, podczas gdy komory do poziomej TLC są wykonane z PTFE i mają szklane pokrywy.
Derywatyzacja
Gdy rozdzielane związki są bezbarwne, nie reagują na promieniowanie UV i nie fluoryzują, derywatyzacja jest stosowana w celu zwiększenia wykrywalności. Odczynnik wykrywający jest nakładany na płytkę (przez rozpylanie lub zanurzanie), aby umożliwić wizualizację chemiczną. Odczynnik wykrywający może być stosowany z systemem rozpuszczalnika (derywatyzacja in situ), przed opracowaniem (derywatyzacja przed chromatografią) lub po opracowaniu (derywatyzacja po chromatografii).
De derywatyzacja in situ zastosowanych próbek:
- Odczynnik wykrywający jest włączony do układu rozpuszczalnika
- Lepsza dystrybucja odczynnika
Przedchromatograficzna derywatyzacja:
- W celu zwiększenia selektywności rozpuszczalnika dla substancji będących przedmiotem zainteresowania
- Do przekształcania związków labilnych w stabilne
Post-chromatograficzna derywatyzacja:
- Do wizualizacji rozdzielonych substancji
- W celu zwiększenia czułości
Ocena
Po usunięciu pozostałości rozpuszczalnika z płytki TLC, chromatogram jest gotowy do oceny jakościowej i ilościowej. W zależności od celów eksperymentu, istnieje wiele metod oceny do wyboru.
Dokumentacja wyników
Staranna dokumentacja chromatogramów zapewnia, że wyniki TLC są dostępne do wykorzystania w przyszłości.
Dokumentacja przez opis
Ponieważ farmakopee nie wymagają wartości hRf, pisemne opisy wyników TLC są dopuszczalne i często stosowane. Metoda ta jest jednak wysoce zależna od umiejętności technika i może być niedokładna.
Dokumentacja poprzez rysowanie, śledzenie i fotokopiowanie
Powszechnym, ale czasochłonnym podejściem jest rysowanie lub śledzenie chromatogramów cienkowarstwowych na papierze i kolorowanie stref. Kserowanie jest szybsze, ale kolory mogą być trudne do dopasowania. Pomimo ich niedokładności i nieefektywności, metody te są akceptowane do celów oficjalnych.
Dokumentacja fotograficzna i wideo
Najdokładniejszymi metodami dokumentowania wyników TLC są fotografia i nagrania wideo. W tym przypadku ważne jest, aby przymocować aparat do statywu i prawidłowo wyrównać go z płytką TLC, aby zapewnić ostre obrazy. Chociaż metody te wymagają nieco więcej umiejętności, dokumentacja jest szybka, wysoce niezawodna i może być przechowywana elektronicznie.
Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.
Nie masz konta użytkownika?