Wysokowydajna chromatografia cienkowarstwowa: Szybka i wydajna metoda analizy odcisków palców roślin leczniczych

Tiên Do, Melanie Broszat, Matthias Nold

Artykuł z Analytix Reporter - Wydanie 2

Ginsenozydy są saponinami triterpenowymi. Większość ginsenozydów składa się ze szkieletu dammaranu (17 węgli w strukturze czteropierścieniowej) z różnymi ugrupowaniami cukrowymi (np. glukozą, ramnozą, ksylozą i arabinozą) przyłączonymi do pozycji C-3 i C-20.

Ponad 30 ginsenozydów zostało zidentyfikowanych i sklasyfikowanych w dwóch kategoriach:

   - 20(S)- protopanaksadiol (PPD) (Rb1, Rb2, Rb3, Rc, Rd, Rg3, Rh2, Rs1)
   - 20(S)-protopanaksatriol (PPT) (Re, Rf, Rg1, Rg2, Rh1). Różnica między PPT
     a PPD polega na obecności grupy karboksylowej w pozycji C-6 w PPD.

Rysunek 1.

Co więcej, zidentyfikowano również kilka rzadkich ginsenozydów, takich jak saponina ocotillol F11 (24-R-pseudoginsenozyd) i pentacykliczna saponina oleananowa Ro (3,28-o-bisdesmoside). Żeń-szeń azjatycki (Panax ginseng) jest powszechnie znany jako prawdziwy żeń-szeń.

W tym artykule przedstawiono metody HPTLC odpowiednie do analizy ginsenozydów przy użyciu sprzętu CAMAG, płytek TLC MilliporeSigma, wzorców analitycznych i materiałów referencyjnych ekstraktu. Materiały referencyjne ekstraktu są produkowane przez HWI Analytik i dystrybuowane wyłącznie przez MilliporeSigma.

Wykrywanie ginsenozydów w odcisku palca HPTLC różnych gatunków Panax (korzenie i ekstrakty z korzeni) uzyskuje się zgodnie z metodami HPTLC monografii Ph. Eur. Monografia¹ Monografia USP DSC 2015² oraz metoda Stowarzyszenia HPTLC (International Association for the Advancement of HPTLC)³ poprzez porównanie wartości RF i kolorów substancji referencyjnych i pasujących stref w ekstrakcie z korzenia. W zależności od przestrzeganych przepisów można zastosować jedną z trzech metod identyfikacji.

Zalecane urządzenia CAMAG:

Automatyczny próbnik TLC (ATS 4), automatyczna komora wywoływania (ADC 2), wizualizator TLC 2, urządzenie do zanurzania chromatogramów 3, podgrzewacz płytek TLC 3 i visionCATS

Odczynnik do derywatyzacji:

Anizaldehyd¹ lub odczynnik kwasu siarkowego^2,3

Próbka:

0.015 g/mL ekstraktu (ekstrakt HWI) w 70%  metanolu1  Uwaga: Odchylenie od metod 2 i 3 dla przygotowania próbki

Standardy:

Standardowe roztwory ginsenozydów przygotowano w stężeniu 0,5 mg/mL w metanolu.

Uwaga: Odchylenie od metody 3 dla objętości aplikacji

Chromatografia zgodnie z USP <203> ⁴:

Faza stacjonarna: HPTLC Si 60 F254 20 x 10 cm (MilliporeSigma)

Zastosowanie próbki: Po 4 µL roztworu badanego i 2 µL wzorców nanosi się w postaci pasm 8 mm, 8 mm od dolnej krawędzi, 20 mm od lewej krawędzi^{1, 3}

Uwaga: Odchylenie od metody 3 dla przygotowania próbki i objętości roztworów referencyjnych i testowych

4 µL roztworu testowego i 4 µL wzorców są nanoszone jako paski 8 mm, 8 mm od dolnej krawędzi, 20 mm od lewej krawędzi²

Uwaga: Odchylenie od metody 2 dla przygotowania próbki

Rozpuszczalnik rozwijający: Octan etylu - woda - butanol 25:50:100 (v/v) - warstwa górna¹

Dichlorometan - etanol - woda 70:45:6.5 (v/v/v)²

Chloroform - octan etylu - metanol - woda 15:40:22:9 (v/v/v)³

Rozwój: W ADC 2 z nienasyconą komorą i po kondycjonowaniu w 33% wilgotności względnej przez 10 min przy użyciu nasyconego roztworu chlorku magnezu¹

Rozwijanie jest wykonywane przy użyciu ADC 2, nasyconego przez 20 min rozpuszczalnikiem rozwijającym (bibuła filtracyjna). Przed wywołaniem płytkę kondycjonuje się przez 10 minut do wilgotności względnej 33% (nasyconym roztworem MgCl2).^{2, 3}

Odległość wywoływania: 70 mm (od dolnej krawędzi)^{1, 2}; 80 mm (od dolnej krawędzi)³

Suszenie płytki: 5 min w strumieniu zimnego powietrza

Derywatyzacja: Płytkę zanurza się (prędkość zanurzania: 3 cm/s, czas zanurzania: 0 s) w odczynniku anizaldehydowym (mieszanina 0.5 ml p-anizaldehydu, 10 ml lodowatego kwasu octowego, 85 ml metanolu i 5 ml kwasu siarkowego) za pomocą urządzenia do zanurzania chromatogramów 3 i ogrzewanego przez 5 minut w temperaturze 105°C.¹

Płytkę zanurza się (prędkość zanurzania: 3 cm/s, czas zanurzania: 0 s) w odczynniku kwasu siarkowego (10% w metanolu) za pomocą urządzenia do zanurzania chromatogramów 3 i ogrzewa przez 5 minut w temperaturze 100°C.^{2, 3}

Ocena: Dokumentacja zgodnie z metodą 3 jest prowadzona w świetle białym 100 °C^{1, 2, 3} i UV 366 nm^{2, 3} po derywatyzacji za pomocą TLC Visualizer 2

Wyniki i dyskusja:

Chromatogramy HPTLC wzorców ginsenozydów i Panax ginseng ekstraktu z korzenia

Chromatogramy HPTLC po derywatyzacji. Ścieżki

1-17: ginsenozydy, ścieżka 18: protopanaksadiol, ścieżka 19: Panax ginseng ekstrakt z korzenia (nr artykułu: 05115001 partia: HWI01294)

Metoda 1: Według Ph. Eur.

Chromatogramy HPTLC w świetle białym po derywatyzacji

Metoda 2: Zgodnie z metodą żeń-szenia Tienshi od

Chromatogramy HPTLC przy UV 366 nm i w świetle białym po derywatyzacji

Metoda 3: Według Stowarzyszenia HPTLC

Chromatogramy HPTLC pod UV 366 nm i w świetle białym po derywatyzacji.

Chromatogramy HPTLC roślin zawierających ginsenozydy (różne gatunki Panax)

P. ginseng, P. quinquefolium, P. notoginseng, P. japonicus, P. vietnamensis  ekstrakty z korzeni i korzeni zostały zebrane i przeanalizowane. Ekstrakt z korzenia P. ginseng (nr artykułu: 0511-50-01 partia: HWI01294) został użyty jako botaniczny materiał referencyjny do identyfikacji żeń-szenia azjatyckiego (ginsenozyd Rf powinien być obecny, a F11 nieobecny).

Metoda 1: Według Ph. Eur.

Chromatogram HPTLC w świetle białym po derywatyzacji.

Ścieżka 1: ginsenozyd Rf (zielona strzałka); 2: ginsenozyd F11 (czerwona strzałka); 3: P. ginseng ekstrakt z korzenia (nr artykułu: 0511-50-01, partia: HWI01294, ginsenozyd Rf wyróżniony zieloną strzałką); 4: P. ginseng root (ginsenoside Rf wyróżniony zieloną strzałką); 5: P. quinquefolium ekstrakt z korzenia (żeń-szeń amerykański, ginsenozyd F11 zaznaczony czerwoną strzałką);
6: P quinquefolium korzeń (żeń-szeń amerykański, ginsenozyd F11 wyróżniony czerwoną strzałką);  7: P. notoginseng ekstrakt z korzenia;
8: P. notoginseng korzeń; 9: P. japonicas korzeń; 10: P. vietnamensis korzeń; 11: dziki wietnamski korzeń żeń-szenia.

.

Metoda 2: Zgodnie z metodą żeń-szenia Tienshi od

Chromatogramy HPTLC przy UV 366 nm i w świetle białym po derywatyzacji

Metoda 3: Według Stowarzyszenia HPTLC

Chromatogramy HPTLC w świetle UV 366 nm i w świetle białym po derywatyzacji.

Metoda 2 & 3 Parametr:

Chromatogramy HPTLC w świetle białym i UV 366 nm po derywatyzacji ginsenozydem Rf (zielone strzałki) i ginsenozydem F11 (czerwone strzałki).

Ścieżka 1: P. ginseng ekstrakt z korzenia (nr artykułu: 05115001 partia: HWI01294, ginsenozyd Rf zaznaczony zielonymi strzałkami); Ścieżka 2: P. ginseng root (ginsenoside Rf wyróżniony zielonymi strzałkami); 3: P. quinquefolium ekstrakt z korzenia (żeń-szeń amerykański, ginsenozyd F11 zaznaczony czerwonymi strzałkami); 4: P quinquefolium korzeń (żeń-szeń amerykański, ginsenozyd F11  wyróżniony czerwonymi strzałkami); 5: P.notoginseng root  extract; 6: P. notoginseng korzeń; 7: P. japonicas korzeń; 8: P. vietnamensis korzeń;
9: dziki wietnamski korzeń żeń-szenia.

Wszystkie przedstawione metodologie są odpowiednie do wykrywania ginsenozydów w różnych gatunkach Panax. Ginsenozyd Rf jest unikalny dla żeń-szenia azjatyckiego, podczas gdy F11 występuje wyłącznie w żeń-szeniu amerykańskim. Tak więc stosunek Rf/F11 jest używany jako marker fitochemiczny do odróżnienia żeń-szenia amerykańskiego od azjatyckiego. W zastosowanym botanicznym materiale referencyjnym (Panax ginseng ekstrakt z korzenia, nr artykułu: 0511-50-01) obecność Rf i brak F11 można było potwierdzić wszystkimi metodami i dlatego nadaje się on do identyfikacji żeń-szenia azjatyckiego.

Metody 1 i 2 mają tę zaletę, że są zgodne z oficjalnymi monografiami w farmakopeach (Ph. Eur. resp. USP). Metoda 3 jest alternatywną metodą dostarczoną przez Stowarzyszenie HPTLC. Metoda została ulepszona w celu oddzielenia Rf i F11, aby lepiej odróżnić żeń-szeń amerykański od azjatyckiego. Derywatyzacja odczynnikiem kwasu siarkowego (metody 2 i 3) prowadzi do różnych kolorowych stref pod UV 366 nm, przydatnych do identyfikacji.

Referencje

1. 2008. Ginseng root: Monograph in Ph. Eur. 8.0. European Directorate for the Quality of Medicines and HealthCare.. 01. Strasbourg: France.

2. 2017. Tienchi Ginseng Root and Rhizome Dry Extract: Monograph in USP 40-NF35. United States Pharmacopeial Convention. USA: Rockville, MD.

3. 2016. HPTLC identification method for Panax ginseng, HPTLC Association (www.hptlc-association.org).

4. 2016. High-Performance Thin-Layer Chromatography Procedure for Identification of Articles of Botanical Origin in USP 39-NF34. United States Pharmacopeial Convention.. USA: Rockville, MD.