Wskazówki i porady dotyczące chromatografii cienkowarstwowej
Monika Bäumle, Global Product Manager TLC, Ilona Matus, Analytical Sciences Liaison
Merck
Wprowadzenie
Chromatografia cienkowarstwowa (TLC) jest szybką, łatwą w użyciu i wysoce wszechstronną techniką separacji do analizy jakościowej i ilościowej. Jest idealna do szybkiej identyfikacji, badań przesiewowych i monitorowania reakcji. Wysoka tolerancja matrycy i możliwość równoległego rozdzielenia wielu próbek sprawia, że TLC jest wysoce efektywna czasowo i kosztowo.
Zasada działania TLC
Ogólny proces chromatografii cienkowarstwowej jest prosty, jednak obejmuje szereg etapów i należy wziąć pod uwagę pewne środki ostrożności (Rysunek 1).
Jednym z przykładów jest faza gazowa w komorze rozwojowej, która wpływa na proces TLC. Dlatego też kluczowe znaczenie ma utrzymanie kontrolowanych warunków gazu i wilgotności w celu uzyskania powtarzalnej wydajności i dokładnych wyników TLC. Poniżej omówimy niektóre z ważnych aspektów, które należy wziąć pod uwagę na różnych etapach.
Rysunek 1.Proces TLC.
Przechowywanie i obsługa płytek TLC
Płytki TLC są materiałami wysoce aktywnymi i mogą adsorbować wilgoć i zanieczyszczenia pochodzące ze środowiska laboratoryjnego. Dlatego zaleca się przechowywanie płytek w czystym i suchym środowisku (np. w eksykatorze). Jeśli to możliwe, zawiń płytki w folię aluminiową i trzymaj je z dala od oparów chemicznych i oparów.
Przygotowanie płytki TLC: Wstępne płukanie (mycie) i aktywacja warstwy
Zanieczyszczenia i wilgoć z otoczenia mogą zmienić wydajność płytki, zwłaszcza gdy nie jest ona prawidłowo przechowywana po otwarciu opakowania. Ponadto na płytkach mogą znajdować się zanieczyszczenia pochodzące ze spoiwa, opakowania lub wcześniejszej obsługi. Zanieczyszczenia te można/powinno się usunąć poprzez wstępne płukanie warstwy. Można to zrobić przez zanurzenie ich w rozpuszczalniku (raz lub dwa razy, 1-7 minut) lub przez ślepą próbę płytki TLC, np. z metanolem. Należy pamiętać o kierunku chromatografii, ponieważ zanieczyszczenia będą koncentrować się na górnej krawędzi płytki.
Aby usunąć związaną wodę z polarnych grup funkcyjnych fazy, zaleca się podgrzewanie płytki przez 20-30 minut w temperaturze 120 °C (w czystym piekarniku) w celu prawidłowej aktywacji płytki.
Przygotowanie próbki TLC
Płytki do chromatografii cienkowarstwowej są urządzeniami jednorazowego użytku, dlatego nie niosą ze sobą ryzyka zanieczyszczenia krzyżowego do przyszłych analiz. Z tego powodu przygotowanie próbki może być zazwyczaj uproszczone, a zatem jest mniej czasochłonne w porównaniu do HPLC. Zaleca się kruszenie/homogenizację próbki i ekstrakcję odpowiednim rozcieńczalnikiem (np. w przypadku próbek stałych), a następnie etapy filtracji i zatężania.
Wybór fazy stacjonarnej w TLC
Wybór fazy stacjonarnej TLC ma kluczowe znaczenie, ponieważ decyduje o selektywności i wydajności separacji. Dostępna jest szeroka gama opcji - na bazie krzemionki, tlenku glinu lub celulozy, modyfikowanych lub niemodyfikowanych. Wybór powinien być związany z właściwościami próbki i celami aplikacji. TLC może pracować w dwóch trybach, normalnym i odwróconym. W trybie fazy normalnej (NP) faza ruchoma jest mniej polarna niż faza stacjonarna na płytce TLC, podczas gdy w trybie fazy odwróconej (RP) faza ruchoma jest bardziej polarna niż faza stacjonarna. Ponad 80% wszystkich separacji TLC przeprowadza się na żelu krzemionkowym jako fazie stacjonarnej, zarówno gołej, jak i zmodyfikowanej np. za pomocą C18.
Jak wybrać system rozpuszczalników do TLC?
Wybór fazy ruchomej w TLC jest kolejnym krytycznym czynnikiem dla uzyskania skutecznego wyniku separacji. Rozpuszczalnik rozpuszcza składniki próbki na warstwie sorbentu i przesuwa je po płytce. Idealne fazy ruchome transportują wszystkie składniki z linii bazowej o końcowych wartościach RF (współczynnik retencji) od 0,15 do 0,85 (idealnie 0,2 - 0,6). Współczynnik retencji definiuje się jako odległość przebytą przez substancję podzieloną przez odległość przebytą przez rozpuszczalnik. Zwykle są one również opisywane jako hRF, który jest definiowany jako 100x RF. Gdy metoda jest opracowywana od podstaw, zazwyczaj jako punkt wyjścia stosuje się mieszaninę polarnego i niepolarnego rozpuszczalnika. Aby zwiększyć wartości RF w NP-TLC, konieczne jest zwiększenie polarności fazy ruchomej. W przypadku, gdy wymagane jest zmniejszenie RF, należy zmniejszyć polarność. Bardzo powszechny układ fazy ruchomej w NP-TLC zawiera heksan i 10-50% octanu etylu (EtOAc). Inne popularne układy rozpuszczalników oparte są na metanolu i dichlorometanie, toluenie lub acetonie. W RP-TLC układy rozpuszczalników są zwykle mieszaninami opartymi na wodzie, metanolu, acetonitrylu lub buforach wodnych.
Zastosowane rozpuszczalniki i mieszanki rozpuszczalników powinny mieć odpowiednią czystość i stabilność, niską lepkość, niską prężność par i niską toksyczność, jeśli to możliwe.
Dodanie pewnych modyfikatorów (zasadowych lub kwaśnych) może poprawić wyniki separacji.
Szczegółowe systematyczne podejście do znalezienia idealnych układów rozpuszczalników może być stosowane w oparciu o opublikowane dane.1
Nakładanie próbek
Próbki mogą być nakładane jako plamki lub pasma poprzez kontakt lub rozpylanie. Nanoszenie próbek przez rozpylanie w paśmie umożliwia uzyskanie lepszych wyników separacji i jest preferowaną metodą w przypadku większej objętości próbki. Dostępny jest specjalny sprzęt do natryskiwania roztworów próbek na płytkę. Metoda ta pozwala uniknąć bezpośredniego kontaktu z warstwą TLC i jest zwykle stosowana do nanoszenia pasmowego.
Polarność rozcieńczalnika próbki jest czynnikiem, który należy wziąć pod uwagę. W NP-TLC stosuje się niepolarne rozcieńczalniki, takie jak n-heksan, które zapewniają, że substancje pozostają w punkcie aplikacji. Jednak w przypadku bardziej polarnych rozcieńczalników (np. toluenu, dichlorometanu, metanolu), substancje próbki są transportowane w kierunku krawędzi "strefy mokrej" (plamka na linii początkowej) i zazwyczaj tworzą okrągłą plamkę chromatograficzną w obszarze początkowym (patrz górna część Rysunku 2). Podobnie jak w przypadku rozwoju chromatograficznego, uzyskuje się piki o prawie gaussowskim rozkładzie, który rozszerza się wraz ze wzrostem polarności rozcieńczalnika (dolna część Rysunku 2).
Rysunek 2.Rozkład substancji w plamce próbki po naniesieniu na płytkę TLC w funkcji rozpuszczalnika.
W zależności od liczby analizowanych próbek wybierz odpowiedni rozmiar płytki lub przytnij większą płytkę do wymaganych wymiarów. Zaznacz strefę aplikacji ołówkiem, rysując linie w poprzek płytki. Uważaj, aby nie uszkodzić/zarysować powierzchni warstwy, ponieważ może to wpłynąć na zachowanie przepływu i prowadzić do błędów. Należy uważać, aby nie nanieść próbki zbyt blisko dolnej krawędzi płytki (8 mm od dolnej krawędzi), ponieważ może to spowodować rozprzestrzenienie się/wyciek punktu początkowego do fazy ruchomej. Objętość próbki do nałożenia zależy od celu analizy i stężenia roztworów próbki. Zazwyczaj zaleca się objętość próbki 0,5-2,0 µL dla testów tożsamości i maksymalnie 10 µL dla testów czystości. Im większa objętość próbki, tym bardziej lotny i niepolarny (dla NP) powinien być rozcieńczalnik i tym wolniej należy przeprowadzać aplikację.
Suszenie płytek przed opracowaniem
Po nałożeniu próbki na płytkę, rozcieńczalnik próbki musi zostać całkowicie usunięty poprzez staranne wysuszenie płytek przed opracowaniem. Na tym etapie należy unikać zanieczyszczenia oparami i wybrać odpowiednią temperaturę, aby nie spowodować dyfuzji lub utraty próbki. Temperatura zależy od rodzaju substancji, ich stabilności i temperatury wrzenia.
Prekondycjonowanie warstwy/kontrola wilgotności
Bez podjęcia specjalnych środków ostrożności podczas nakładania próbki, wilgotność w laboratorium może zmniejszyć aktywność warstwy TLC w ciągu kilku minut, ponieważ szybko ustala się równowaga między atmosferą laboratorium a sorbentem. Wstępne kondycjonowanie płytki TLC przed wywoływaniem pomaga uniknąć jej pogorszenia. Dlatego należy kondycjonować płytki (po nałożeniu próbki) przez 45 minut w nasyconym roztworze soli w zamkniętej komorze. W zależności od pożądanej wilgotności względnej, zwykle zaleca się stosowanie kilku nasyconych roztworów soli, na przykład wilgotność względną 33% można osiągnąć stosując nasycony roztwór MgCl2. Upewnij się, że w roztworze nadal znajduje się nierozpuszczona sól, aby zapewnić nasycenie. Po kondycjonowaniu ważne jest, aby natychmiast rozwinąć płytkę, aby zapobiec ponownemu wystąpieniu zmian.
Rozwój chromatogramu/płytki
Rozwój płytek TLC można przeprowadzić za pomocą różnych technik, np. jednowymiarowych, dwuwymiarowych lub procesów wymuszonego przepływu. Rozwój jednowymiarowy może być pojedynczy lub wielokrotny i przebiega pionowo, poziomo lub kołowo. W większości przypadków separacja odbywa się pionowo w komorze rozwojowej.
Najpierw dodaj świeżo przygotowaną fazę ruchomą do komory rozwojowej do poziomu max. 0,5 cm (linia zanurzenia). Przed rozpoczęciem procesu rozwoju wymagana jest równowaga między ciekłą fazą ruchomą a fazą gazową, aby osiągnąć nasycenie komory. Aby to przyspieszyć, należy dodać podkładkę nasycającą lub umieścić bibułę filtracyjną wewnątrz komory (ściana komory) i wyrównać przez 20 minut (komora powinna być zamknięta). Po nasyceniu komory szybko umieść płytkę wewnątrz komory. Jak tylko faza ruchoma pokona dwie trzecie wymiaru płytki (maks. do 1 cm od góry), wyjmij płytkę i zaznacz czoło rozpuszczalnika.
Derywatyzacja w TLC
Po rozdzieleniu, zwykle przeprowadza się derywatyzację, aby umożliwić wizualizację analitów i wzmocnić wykrywanie, jeśli składniki próbki są bezbarwne lub nie fluoryzują. Idealnie dobrany odczynnik do derywatyzacji/wykrywania zależy od docelowych analitów i pożądanej metody wykrywania. Można go zastosować przed opracowaniem (derywatyzacja przed chromatografią), z systemem rozpuszczalnika (derywatyzacja in situ) lub po opracowaniu (derywatyzacja po chromatografii).
W przypadku derywatyzacji po chromatografii lub wizualizacji analitów, odczynnik nakłada się na płytkę przez rozpylanie lub zanurzanie. Zaletą rozpylania jest jego wysoka elastyczność i niska wymagana ilość odczynnika. Jednak ręczne rozpylanie często nie zapewnia wystarczającej powtarzalności.
Derywatyzacja przez zanurzenie pozwala na bardziej jednorodną i powtarzalną derywatyzację, ale wymaga więcej odczynnika. Poza tym może wystąpić zabarwienie tła. Upewnij się, że dokładnie wytarłeś tylną stronę płytki po derywatyzacji i przed odczytem.
Jak odczytywać płytki TLC?
Wykonanie TLC we właściwy sposób zapewni powtarzalne i precyzyjne wyniki zarówno dla analizy jakościowej, jak i ilościowej.
Więcej wskazówek i trików dotyczących procesu wizualizacji i dokumentacji omówimy w osobnym artykule.
Referencje
Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.
Nie masz konta użytkownika?