용해 및 단백질 추출

분석을 위한 세포 파쇄 및 내용물 전처리를 위한 수 많은 방법이 있습니다. 일반적으로, 연성법은 쉽게 용해되는 배양 세포 또는 혈액 세포로 구성된 샘플의 경우에 이용되며, 강성법은 더 강한 박테리아 또는 식물 세포나 결합조직에 묻힌 포유류 세포의 파쇄를 위해 사용됩니다.

• 세제 기반 용해: 세제 기반 용해: 세제 용해는 포유류 세포, 박테리아 세포, 효모, 식물에 사용할 수 있는 부드러운 방법입니다. 세포 현탁액은 부드럽게 원심분리하여 세포막을 용해시키는 세제가 들어있는 용해 용액에서 재부유됩니다. 세포막은 용해화되고, 세포는 용해되어 내용물을 방출합니다. 세제가 분석 또는 생산을 방해하는 경우 다음 단계에서 제거해야 할 수 있습니다.
• 냉동-해동 용해: 이 방법은 포유류 또는 박테리아 세포의 부유물에 적용됩니다. 세포 부유물은 액체 질소를 사용하여 급격히 냉동합니다. 그리고 나서 샘플은 해동되어 용해 완충액에서 파이펫을 이용하거나 부드럽게 교반하여 재부유되며, 해당 과정을 여러 번 반복합니다. 주기 사이에서 샘플은 원리분리되고 수용성 단백질을 포함하는 상층액을 얻습니다.
• 삼투압 충격: 이는 상당히 조심스러운 방법이며 세제 사용 없이 부유성 포유류 또는 박테리아 세포의 용해에 충분할 수 있습니다. 기계적 파쇄법과 빈번히 사용되는 이 방법은 고삼투압에서 저삼투압 매질의 변경에 의존하며 용해물이 후속적으로 세포하부 성분으로 분획되는 애플리케이션에 양호하게 적절합니다.
• 초음파파쇄: 이러한 단백질 추출법은 세포 부유물에 가장 빈번히 적용됩니다. 세포는 샘플에 삽입된 프로브를 통한 고주파 음파에 의해 파쇄됩니다. 음파는 저압력 영역을 생성하여 세포막 파쇄를 유발합니다.
• 기계적 파쇄법: 다양한 거칠지만 효과적인 “크러싱 앤 그라인딩“ 방법을 사용해 세포 및 조직으로부터 단백질을 추출합니다. 예를 들면, 세포막은 Dounce 또는 Potter-Elvehjem 균질화를 이용한 액체 전단력으로 파쇄합니다. 조직은 Waring 믹서기 또는 Polytron® 균질기를 이용하여 냉장 완충액에서 쳐서 자르기 또는 다지기로 균질화됩니다. 조직 또는 세포는 액체 질소에서 냉각되어 알루미나 또는 모래와 함께 막자와 막자발을 활용하여 미세한 분말로 분쇄될 수 있습니다. 미세한 유리구술과 함께 세포를 빠르게 교반하여 세포벽을 파쇄하며, 대부분의 그람 양성 및 그람 음성 박테리아에 효과적입니다.
• 효소성 분해: 효소성 분해: 효소성 방법은 단단한 보호 구조로 둘러싸인 세포막이 있는 섬유성 조직에 내재된 박테리아, 효모 또는 진핵 세포로부터 단백질을 추출할 때 빈번히 사용됩니다. 리소자임, Mutanolysin, MetaPolyzyme, Lysonase, Pronase와 같은 세포 용해 효소 또는 칵테일은 조직 소화 효소(즉, 콜라겐 효소, 콘드로이티네이스, 히알로니다제)와 함께 사용하여 세포벽, 피막, 캡슐, 캡시드 또는 기계적인 방법만으로 쉽게 분해되지 않는 다른 구조를 용해하거나 파괴할 수 있습니다. 효소성 분해 다음에는 용해 완충액에서 균질화, 음파파쇄 또는 격렬한 교반이 이어집니다.

또한 내인성 프로테아제 및 포스파타아제는 세포 파쇄 시에 방출되어 표적 분자를 분해할 수 있기 때문에 세포 파쇄 및 추후 정제 중에 프로테아제 및 포스파타아제 억제제를 사용하여 표적의 조절되지 않은 손실을 피하기 위해 샘플을 보호합니다.