TRI Reagent^® 프로토콜

TRI Reagent^®가 무엇인가요?

TRI Reagent^® 용액(TRIzol로도 판매됨)은 인간, 동물, 식물, 효모, 박테리아, 바이러스의 생물학적 시료로부터 DNA, RNA 및 단백질을 분리하는 데 사용되는 단상 용액에 구아니딘 티오시안산염과 페놀을 섞은 혼합물입니다. 이것은 RN아제 활동을 억제합니다. TRI Reagent^®은 RNA, DNA 또는 단백질을 추출하는 생물학적 시료를 균질화하기 위해 사용됩니다.

절차

시료 제조

1A. 조직:
Polytron^® 또는 기타 적정 균질기에서 TRI 시약(조직 50-100 mg당 1 ml)의 조직 시료를 균질화합니다.

참고: DNA를 최소한으로 절단하려면 Polytron이 아닌 균질기를 느슨하게 장착하여 사용하십시오(DNA 분리, 3단계, note b 참조). 조직 부피는 TRI 시약 부피의 10 %를 초과해서는 안 됩니다.

1B. 단분자층 세포:
배양 접시에 직접 세포를 용해합니다. 유리 배양 플레이트 표면 면적 10 cm²당 TRI 시약 1 ml를 사용합니다. 시약을 추가한 후 균일한 세포 용해물을 형성하기 위해 피펫으로 여러 번 통과시켜야 합니다.

참고: TRI 시약은 플라스틱 배양 플레이트에 사용해서는 안 됩니다.

1C. 현탁 세포:
원심분리기로 셀을 분리한 후 피펫팅을 반복하여 TRI 시약에 용해합니다. 5-10 × 10⁶의 동물성, 식물성 또는 효모균 세포 또는 10⁷ 박테리아 세포를 용해하는 데 시약 1 ml 정도면 충분합니다.

참고:

• 시료가 지방, 단백질, 다당류 또는 식물의 근육, 지방 조직, 결절 부분과 같은 세포 밖 물질을 높은 함량으로 가지고 있다면 추가적인 단계가 필요할 수 있습니다. 균질화 후 2-8 °C에서 10분 동안 12,000 × g에서 균질액을 원심분리하여 불용성 물질(세포외 멤브레인, 다당류, 고분자질량 DNA)을 제거합니다. 상청액에는 RNA와 단백질이 포함되어 있습니다. 시료가 높은 지방 함량을 가지고 있는 경우 액상 표면에 지방층이 존재하며, 이 층을 제거해야 합니다. 깨끗한 상청액을 새로운 튜브에 옮기고 2단계를 진행합니다. 2단계와 3단계의 DNA 분리에 따라 팰릿에서 고분자 질량 DNA를 회수합니다.
• 일부 효모와 박테리아 세포는 균질화제가 필요할 수 있습니다.
• 셀이 균질화되었거나 TRI 시약에 용해된 후에는 –70 °C에서 최대 1개월 동안 시료를 보존할 수 있습니다.

상 분리: 핵 단백질 복합체를 완전하게 분리하기 위해 시료를 실온에서 5분 동안 배양합니다. 사용된 TRI 시약 1 ml당 1‑bromo-3‑chloropropane 0.1 ml 또는 클로로폼 0.2 ml(상 분리의 참고 a 및 b 참조)를 첨가합니다. 시료를 단단히 밀봉하고 15초 동안 강하게 흔들어준 후 실온에서 2-15분 동안 보관합니다. 2-8 °C에서 15분 동안 12,000 × g로 원심분리합니다. 원심분리에서는 혼합물을 적색 유기상(단백질 포함),간기(DNA 포함), 무색 액상(RNA 포함)의 3단계로 분리합니다.

참고:

• 1-브로모-3-클로로프로페인은 클로로폼보다 독성이 적으며 위상분리에 사용 시 RNA를 DNA로 오염시킬 가능성이 줄어듭니다.⁴
• 위상 분리에 사용되는 클로로폼에는 이소아밀 알코올 또는 기타 첨가제가 함유되어 있지 않아야 합니다.
• 액상에서 폴리 A⁺ 일부를 분리하려면 부록 I을 참조하십시오.

RNA 분리 또는 추출

1. 액상을 새 튜브에 옮기고 시료 제조에 사용된 TRI 시약 1 ml당 0.5 ml의 2-propanol을 1단계에 넣고 혼합합니다. 시료를 실온에서 5-10분 동안 보관합니다. 2-8 °C에서 10분 동안 12,000 × g로 원심분리합니다. RNA 침전물이 튜브의 측면과 바닥에 팰릿을 형성하게 됩니다.

참고: 간기 및 유기상은 DNA와 단백질의 후속 분리를 위해 2-8 °C로 유지합니다.

2. 상청액을 제거하고 1단계의 시료 제조에 사용된 TRI 시약 1 ml당 75 %의 에탄올을 최소 1 ml 첨가하여 RNA 팰릿을 세척합니다. 시료를 흔들어 섞은 후 2-8 °C에서 5분 동안 7,500 × g로 원심분리합니다.

참고:

• RNA 팰릿이 부유하면 12,000 × g에서 75 % 에탄올로 씻어냅니다.
• 시료는 2-8 °C에서 최소 1주, -20 °C에서 최대 1년까지 에탄올로 저장할 수 있습니다.

3. RNA 팰릿을 공기 중 또는 진공 상태에서 5-10분 동안 대략 건조시킵니다. 용해도가 크게 저하되므로 RNA 팰릿을 완전히 건조시키지 마십시오. RNA 팰릿을 진공 상태(Speed-Vac®)에서 원심분리하여 건조시키지 마십시오. RNA 팰릿에 적절한 양의 포름아미드, 물 또는 0.5 % SDS 용액을 첨가합니다. 확실한 용해를 위해 55-60 °C에서 10-15분 동안 마이크로피펫으로 피펫팅을 반복하여 혼합합니다.

참고:

• 최종적인 RNA 배지 제조에는 DNA와 단백질이 포함되지 않습니다. A260와 A280 비율은 1.7 이상이어야 합니다.
• 조직(mg RNA/mg 조직)에서 얻은 통상 산출량: 6-10 mg(간, 비장), 3-4 mg(신장), 1-1.5 mg(골격근, 뇌), 1-4 mg(태반)
• 배양 세포(mg RNA/106 세포)에서 얻은 통상 산출량: 8-15 mg(상피 세포), 5-7 mg(섬유아세포)
• 아가로스 겔의 RNA의 에티디움 브로마이드 염색은 작은(2 kb) 리보솜 RNA와 큰(5 kb) 리보솜 RNA, 저분자 질량 (0.1-0.3 kb) RNA와 고분자질량 (7-15 kb) RNA로 이루어진 두 개의 뚜렷한 띠를 보여줍니다.

DNA 분리 또는 추출

1. 간기에 남은 액상을 조심스럽게 제거하여 폐기합니다. 간기 및 유기상에서 DNA를 침전시키려면 1단계의 시료 제조에 사용된 TRI 시약 1 ml당 100 %의 에탄올을 0.3 ml 첨가합니다. 뒤집어서 섞은 뒤 실온에서 2-3분 동안 보관합니다. 2-8 °C에서 5분 동안 2,000 × g로 원심분리합니다.

참고: DNA 침전 이전에 남아있는 액상을 제거하는 일은 DNA 분리 품질에 중요한 단계입니다.

2. 상청액을 제거하고 단백질 분리를 위해 2-8 °C에서 보관합니다. DNA 팰릿을 0.1 M 시트르산삼나트륨, 10 % 에탄올 용액에 두 번 세척합니다. 시료 제조 1단계에서 사용된 TRI 시약 1 ml당 세척 용액 1ml를 사용합니다. 각 세척마다 DNA 팰릿을 최소 30분 동안(경우에 따라 혼합하여) 유지합니다. 2-8 °C에서 5분 동안 2,000 × g로 원심분리합니다. DNA 팰릿을 75 % 에탄올(1 ml당 1.5-2 ml)에 재현탁하고 실온에서 10-20분간 기다립니다.

참고:

• 중요: 시료를 세척 용액에 담그는 시간을 줄이지 마십시오. 30분은 DNA에서 페놀을 효율적으로 제거하기 위해 절대적으로 필요한 최소 시간입니다.
• 팰릿이 200 mg 이상의 DNA 또는 DNA가 아닌 물질을 다량 함유하고 있는 경우 0.1 M 시트르산삼나트륨으로 추가 세척해야 하며, 10 %의 에탄올 용액이 필요합니다.
• 75 % 에탄올에 현탁한 시료는 2-8 °C에서 수개월 동안 보관할 수 있습니다.

3. DNA 팰릿을 진공 상태에서 5-10분 동안 건조시킨 후 마이크로피펫으로 천천히 피펫팅을 반복하여 8 mM NaOH로 용해합니다. 0.2-0.3 mg/mL의 최종 DNA 농도에 충분한 8 mM NaOH를 첨가합니다(일반적으로 0.3-0.6 ml를 107 세포에서 분리된 DNA 조직 50-70 mg에 첨가). 이 순한 알칼리성 용액으로 DNA 팰릿을 완전히 용해할 수 있습니다. 12,000 × g에서 10분 동안 원심분리하여 불용성 물질을 제거하고 상청액을 새 튜브로 옮깁니다.

참고:

• 점성이 있는 상청액은 고분자 질량 DNA가 있다는 의미입니다.
• DNA의 크기는 균질화 과정에서 가해지는 힘에 따라 달라질 수 있습니다. Polytron 균질기를 사용하지 마십시오.
• 8 mM NaOH에서 용해된 시료는 2-8 °C에서 하룻밤 동안 저장할 수 있습니다. 장기간 보관 시에는 pH값을 7-8로 조정하고 EDTA를 보충합니다(최종농도 1 mM).
• DNA 농도를 측정하려면 부분 표본을 제거하고 물로 희석한 후 A260을 측정합니다. 이중 나선형 DNA의 경우 1 A260 단위/ml = 50 µg/ml입니다.
• 세포 수를 계산하기 위해 인간, 쥐, 생쥐의 106개의 디플로이드 세포에 대한 DNA의 양이 각각 7.1 µg, 6.5 µg, 5.8 µg이라고 가정합니다.
• 조직(μg DNA/mg 조직): 3-4 μg(간, 신장), 2-3 μg(골격근, 뇌, 태반)
• 배양된 인간, 쥐 및 생쥐 세포의 일반적인 산출물: 5-7 µg DNA/106 세포

PCR로 DNA를 증폭하는 방법

8 mM NaOH에서 용해 후 HEPES(0.1 M HEPES 86 µL, free acid/ml DNA 용액)를 사용하여 pH 8.4로 조정합니다. PCR 혼합제에 시료(일반적으로 0.1-1 µg)를 첨가하고 PCR 프로토콜을 따릅니다.

제한 효소로 DNA를 증해하는 방법

HEPES를 사용하여 제한 효소 증해에 필요한 DNA 용액의 pH를 조정하거나, 1 mM EDTA, pH 7-8에서 시료를 투석합니다. 제한 효소 증해는 최적의 조건에서 3-24시간 동안 지속합니다. 1 µg의 DNA당 3-5 단위의 효소를 사용하는 것을 권장합니다. 일반적으로, 80-90 %의 DNA가 증해됩니다.

단백질 분리

1. 1단계 시료 제조에 사용된 TRI 시약 1 ml당 1.5 ml의 2-propanol을 사용하여 페놀-에탄올 상청액(DNA 분리, 2단계)의 단백질(참조 확인)을 침전시킵니다. 실온에서 최소 10분 이상 시료를 놓아두십시오. 2-8 °C에서 10분 동안 12,000 × g로 원심분리합니다.

참고: 일부 시료의 경우 단백질 팰릿이 1 % SDS(3단계)에서 용해되기 어려울 수 있습니다. 다음의 대체 방법을 사용하여 문제를 해결하십시오.

• 2-8 °C에서 0.1 % SDS의 3가지 변화에 대비하여 페놀-에탄올 상청액을 투석합니다.
• 투석액을 2-8 °C에서 10분 동안 10,000 × g로 원심분리합니다.
• 깨끗한 상청액은 웨스턴 블로팅 절차에 적합한 단백질을 함유하고 있습니다.

2. 상청액을 폐기하고 팰릿을 0.3 M 구아니딘염산을 사용하여 95 % 에탄올 용액에 3회 세척하고 시료를 제조합니다. 이때 시료 제조 1단계에 사용된 TRI 시약 1 ml당 2 ml를 사용합니다. 각 세척 도중 시료를 실온에서 20분 동안 세척 용액에 보관합니다. 2-8 °C에서 5분 동안 7,500 × g로 원심분리합니다. 3회 세척 후 100 % 에탄올 2 ml를 넣고 단백질 팰릿을 강하게 회전시켜 섞습니다. 실온에서 20분 동안 유지합니다. 2-8 °C에서 5분 동안 7,500 × g로 원심분리합니다.

참고: 0.3 M 구아니딘염산에 95 % 에탄올 용액 또는 100 % 에탄올로 용해한 단백질 시료는 2-8 °C에서 1개월 또는 –20 °C에서 1년 동안 저장할 수 있습니다.

3. 단백질 팰릿을 진공 상태에서 5-10분 동안 건조시킵니다. 팁이 있는 마이크로피펫 플런저를 용액에 작동시켜 팰릿을 1 % SDS에 용해합니다. 불용성 물질은 2-8 °C에서 10분 동안 10,000 × g로 원심분리하여 제거하고 상청액을 새 튜브로 옮깁니다. 단백질 용액은 웨스턴 블로팅에 즉시 사용하거나 –20 °C에서 보관해야 합니다.

문제해결 지침

1. RNA 분리

A. 낮은 수익률의 원인

• 균질화 또는 시료 투석이 불완전합니다.
• 최종 RNA 팰릿이 완전히 용해되지 않았습니다.

B. A260 대 A280 비율이 1.65 이하인 경우

• 균질화에 사용된 시료의 양이 너무 적습니다.
• 균질화 후 5분 동안 상온에서 시료를 유지하지 않았습니다.
• 액상이 페놀 수지로 오염되었습니다.
• 최종 RNA 팰릿이 완전히 용해되지 않았습니다.

C. RNA의 성능이 저하된 경우

• 조직을 동물에서 제거한 후에 즉시 처리하지 않았거나 냉동되었습니다.
• 분리 또는 분리된 RNA 제조에 사용된 시료가 절차에 명시된 -70 °C가 아닌 -20 °C에 저장되었습니다.
• 세포가 트립신 증해로 인해 분해되었습니다.
• 절차에 사용하는 수용액 또는 튜브에 RNA가 없습니다.
• 아가로스 겔 전기 이동에 사용되는 포름알데히드의 pH 값이 3.5 미만입니다.

D. DNA 오염이 있는 경우

• 시료 균질화에 사용된 시약의 양이 너무 적습니다.
• 분리에 사용된 시료에 유기용제(에탄올, DMSO), 강력한 완충제 또는 알칼리성 용액이 함유되었습니다.

2. DNA 분리

A. 낮은 수익률의 원인

• 균질화 또는 시료 투석이 불완전합니다.
• 최종 DNA 팰릿이 완전히 용해되지 않았습니다.

B. A260 대 A280 비율이 1.70 이하인 경우

• DNA 제조에서 페놀이 충분히 제거되지 않았습니다. 0.1 M 시트르산삼나트륨, 10 % 에탄올 용액으로 DNA 팰릿을 한 번 더 세척하십시오.

C. DNA의 성능이 저하된 경우

• 조직을 동물에서 제거한 후에 즉시 처리하지 않았거나 냉동되었습니다.
• 분리에 사용된 시료가 절차에 명시된 -70 °C가 아닌 -20 °C에 저장되었습니다.
• 시료가 Polytron 또는 다른 고속 균질기로 균질화되었습니다.

D. RNA 오염이 있는 경우

• 유기상 및 간기와 더불어 너무 많은 액상이 남아있습니다.
• DNA 팰릿은 0.1 M 시트르산삼나트륨, 10 % 에탄올 용액으로 충분히 세척되지 않았습니다.

3. 단백질 분리

A. 낮은 수익률의 원인

• 균질화 또는 시료 투석이 불완전합니다.
• 최종 단백질 팰릿이 완전히 용해되지 않았습니다.

B. 단백질의 성능이 저하된 경우

• 조직을 동물에서 제거한 후에 즉시 처리하지 않았거나 냉동되었습니다.

C. 페이지에 밴드 변형이 표시되는 경우

• 단백질 팰릿을 충분히 씻어 내지 않았습니다.

부록

I. Poly A + RNA의 격리
2-propanol(RNA 분리, 1단계)로 RNA가 침전된 후, 팰릿을 폴리 A+ 결합 버퍼에 용해시킨 후 올리고-dT 셀룰로오스 칼럼을 통과하여 Aviv와 Leder의 절차에 따라 선택적으로 mRNA를 제거합니다.³

II. 분리된 RNA는 RT-PCR에 사용됩니다

1. 초기 시료 제조 단계인 1B 단계에서 추가 원심분리 단계를 수행하여 절차를 수정하면 TRI 시약 LS에서 추출한 RNA에서 DNA 오염 가능성을 최소화할 수 있습니다.

2. RNA 시료를 RT-PCR에 사용하려면 보다 완전한 에탄올 증발이 필요합니다. 이는 특히 소량 시료(5-20 μL)에서 매우 중요하며, 적절하게 건조되지 않을 경우 상대적으로 높은 수준의 에탄올을 포함할 수 있습니다.

참고문헌

1. Chomczynski P. 1993. A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples. Biotechniques. 15(3):536-7.

2. Chomczynski P, Sacchi N. 1987. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 162(1):156-159. https://doi.org/10.1016/0003-2697(87)90021-2

3. Aviv H, Leder P. 1972. Purification of Biologically Active Globin Messenger RNA by Chromatography on Oligothymidylic acid-Cellulose. Proceedings of the National Academy of Sciences. 69(6):1408-1412. https://doi.org/10.1073/pnas.69.6.1408

4. Chomczynski P, Mackey K. 1995. Substitution of Chloroform by Bromochloropropane in the Single-Step Method of RNA Isolation. Analytical Biochemistry. 225(1):163-164. https://doi.org/10.1006/abio.1995.1126