세포 또는 조직에서 단백질을 추출하는 모든 단계(신선 또는 동결)는 2-8°C에서 수행되어야 합니다. 다음은 단백질 시료 조제에 사용되는 일반적인 한 용해 완충액의 조성입니다. 계산기 페이지에 방문하여 완충액 조제법 목록 및 그 외 웨스턴 블로팅 솔루션에 대해 알아보십시오.
즉시 사용 가능한 단백질 추출용 RIPA 완충액(제품번호 R0278)
- NaCl(S3014) 150 mM
- Triton X-100(T8787) 1%
- Sodium deoxycholate(D6750) 0.5%
- SDS(74255) 0.1%
- Tris-HCl(T1503) pH 8.0, 50 mM
단백질분해효소 억제제 - 시료 조제 동안 단백질 소실을 방지하십시오
단백질 추출 프로토콜 단계
- 세포가 있는 배양접시에서 배지를 버리고 ice-cold PBS를 사용하여 세포를 씻어냅니다.
- PBS을 버리고, ice-cold 용해 완충액을 추가합니다.
- 차가운 플라스틱 세포 스크레이퍼를 이용하여 세포를 긁어냅니다. 마이크로원심분리기 튜브에 세포를 수집합니다.
- 마이크로원심분리기 튜브 내의 내용물을 4°C에서 30분 동안 교반합니다.
- 튜브를 16,000 x g 및 4°C에서 20분 동안 원심분리합니다. 상청액을 깨끗한 튜브에 수집한 뒤 얼음에 둡니다. 펠릿을 버립니다.
부유액에서 세포로부터 단백질 추출
- 세포 부유액을 2,000 x g 및 4°C에서 5-7분 동안 원심분리합니다. 튜브 바닥의 세포를 수집하고, 상청액은 버립니다.
- 세포 펠릿에 ice-cold PBS를 추가하고 2,000 x g 및 4°C에서 5-7분 동안 원심분리하여 세포를 씻어냅니다.
- ice-cold 용해 완충액을 세포 펠릿에 추가합니다. 마이크로원심분리기 튜브 내의 내용물을 4°C에서 30분 동안 교반합니다.
- 튜브를 16,000 x g 및 4°C에서 20분 동안 원심분리합니다. 상청액을 깨끗한 튜브에 수집한 뒤 얼음에 둡니다. 펠릿을 버립니다.
조직에서 단백질 추출
- 관심 조직을 얼음 상에서 박리합니다. 조직을 바닥이 둥근 마이크로원심분리기 튜브로 옮겨서 액체질소에 담궈 즉시 냉동합니다.
- 5 mg 조직에 대해 ice-cold 용해 완충액 300 µL를 추가하고 전기 균질기를 이용하여 균질화합니다. 균질화하는 동안 용해 완충액을 300-600 µL만큼 추가로 첨가합니다.
- 내용물을 4°C에서 2시간 동안 교반합니다.
- 튜브를 16,000 x g 및 4°C에서 20분 동안 원심분리합니다. 상청액을 깨끗한 튜브에 수집한 뒤 얼음에 둡니다. 펠릿을 버립니다.
시료의 총 단백질 농도를 정규화
- 용해물을 소량 취해 단백질 평가 분석을 수행합니다.
- 알려지지 않은 시료의 단백질 농도를 표준물과 비교함으로써 측정하되, 해당 표준이 알려지지 않은 시료와 동일한 완충액으로 희석되었다는 것을 보장하도록 합니다. 단백질 평가는 Coomassie 단백질 분석 시약(제품번호 27813), BCA 분석, 280 nm에서의 흡광도를 이용하여 수행될 수 있습니다.
- 용해물의 적절한 양을 마이크로원심분리기 튜브로 옮겨 전체 시료가 동일한 총 단백질 농도를 함유하도록 합니다.
- 충분한 ice-cold 용해 완충액을 추가하여 모든 용해물이 동일한 부피가 되도록 합니다.
시료를 Laemmli 로딩 완충액과 혼합합니다.
다음은 전기영동을 위한 시료 조제에 필요한 로딩 완충액의 조성입니다.
2X Laemmli 로딩 완충액:
- Bromophenol blue(제품번호 B5525) 0.004%
- 2-mercaptoethanol 10%
- Glycerol(제품번호 G5516) 20%
- SDS(제품번호 74255) 4%
- Tris-HCl(제품번호 T1503) 0.125 M
- 세포 용해 용량에 동일한 양의 로딩 완충액을 추가합니다.
- 위의 혼합물을 95°C에서 5분 동안 끓입니다. 16,000 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
- 이 시료는 -20°C에 보관하거나 겔 전기영동을 진행할 때 사용할 수 있습니다.
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