イオン交換クロマトグラフィー

図1 Genopureプラスミドの精製手順。フィルターろ過による細胞溶解物清澄化の概略図

イオン交換クロマトグラフィーは、Genopure Plasmid Midi Kit とGenopure Plasmid Maxi Kit で採用されています。精製方法は、改変型アルカリ溶解プロトコールに基づいており、図1に概説されている以下のステップに分けることができます。

• 細菌の採取と分解
• 細菌の「染色体」DNAの沈殿
• 細菌溶解物の除去
• 洗浄ステップによる残留不純物の除去
• 高塩濃度条件によるプラスミドDNAの溶出
• アルコール沈殿による濃縮と塩分除去

この分離方法は、LB培地での培養に最適化されています。LB培地以外の栄養培地では、懸濁バッファー、溶解バッファー、および中和バッファーの増量と、追加の洗浄ステップが必要になる場合があります。精製手順は、すべてのプラスミドサイズに適しています。大きな構成物（最大100 kb）を含む溶解物は、せん断を避けるためにフィルターろ過によって除去しておく必要があります。

プラスミドDNA沈殿物の収量は、培養における増殖の質、精製に使用される培養懸濁液の量、プラスミドの種類などのパラメーターによって左右されます。経験則として、高コピー数プラスミドの標準的な収量は、元の細菌培養液（XL1-Blue、HB101、JM 109などの一般的な宿主株におけるpUC、pTZ、pGEM）1 mlあたり約3〜5 µgのDNAです。低コピー数プラスミドの標準的な収量は、元の細菌培養液1 mLあたり約0.2〜1 µgのDNAです。

Genopureキットには、アルカリ溶解後の時間のかかる遠心分離ステップを省けるよう、折りたたみ型フィルターが付属しています。それぞれ約2分間（midi ）または10分間（maxi ）放置することで、細胞破片とドデシル硫酸カリウムの沈殿物がフィルターによって捕捉され、大きなDNA複合体のせん断を回避できます。精製時間の大幅な短縮に加えて、フィルターろ過のもう1つの利点は、従来の遠心分離では分離できない小さなSDS沈殿物も完全に除去できることです。