cOmplete™ Hisタグ精製レジンのプロトコルとトラブルシューティング

Hisタグレジンのプロトコル

製品番号COHISR-RO

ÄKTAexplorer 100システムを使用したネイティブ条件下でのFPLC精製

ÄKTAexplorer 100システムを使用した自動高速タンパク質液体クロマトグラフィー（FPLC）の詳細な手順は、cOmplete Hisタグ精製カラム（06781535001、06781543001）の使用説明書に記載されています。「精製プロトコル」>「ネイティブ条件下での精製」の章を参照してください。

ÄKTAexplorer 100システムを使用した変性条件下でのFPLC精製

ÄKTAexplorer 100システムを使用した自動高速タンパク質液体クロマトグラフィー（FPLC）の詳細な手順は、cOmplete Hisタグ精製カラム（06781535001、06781543001）の使用説明書に記載されています。「精製プロトコル」>「変性条件下での精製」の章を参照してください。

クロマトグラフィー精製プロトコル

cOmplete Hisタグ精製レジンを使用した精製は、バッチ処理、自然落下によるカラム精製、自動クロマトグラフィーシステムを使用した自動処理など、さまざまな一般精製フォーマットと互換性があります。

FPLC用途のためのカラムパッキング手順

cOmplete Hisタグ精製レジンは、20%エタノール溶液の50%懸濁液として提供されます。

1. ボトルを数回転倒させて、cOmplete Hisタグ精製レジンを再懸濁します。
2. 気泡がアダプターやゲルベッドに混入しないように注意しながら、適切な量のレジンをピペットでクロマトグラフィーカラムに移します。
3. レジンを沈殿させ、
4. 自然落下によって余分なバッファーをカラムから排出させます。
5. トップアダプターを挿入し、ベッドの上部に位置を合わせます。
6. カラムをクロマトグラフィーシステム／バッファーリザーバーに接続します。
7. 「技術仕様」に記載された流量を使用します。

ネイティブ条件下での精製

ネイティブタンパク質の精製は、目的タンパク質に最適なバッファー条件で実施する必要があります。このドキュメントで推奨されているバッファーは、十分に確立されたものであり、特定の目的タンパク質に最適化するよう調整することもできます。
cOmplete Hisタグ精製レジンには、妥協することなく最適なバッファー条件を選択できる柔軟性があります。
：注意cOmplete Hisタグ精製レジンは、以下に示すバッファーAとバッファーBに最適化されています。これ以外のバッファーでも同様に機能すると考えられますが、事前に予備試験する必要があります。
バッファーA：50 mM NaH₂PO₄、pH 8.0／300 mM NaCl
バッファーB：50 mM NaH₂PO₄、pH 8.0／300 mM NaCl／250 mMイミダゾール

1. 10カラム容量のバッファーAでカラムを平衡化します。
2. Hisタグタンパク質を含む清澄なサンプル（超遠心分離やフィルターろ過等により得られたもの）を、5 mLベッド容量のレジンの場合は2.5 mL/分、1 mLベッド容量の場合は0.5〜1 mL/分の体積流量でカラムにロードします。注意：レジンの詰まりを防ぐため、カラムにロードする前に不溶性物質を除去しておいてください。：注意このレジンの結合特異性は高いため、タンパク質の結合の反応速度は他のレジンよりも遅くなります。高い体積流量でロードすると、タンパク質の収量が減少する可能性があります。
3. 吸光度（A₂₈₀）がベースラインレベルになるまで、バッファーAでカラムを洗浄します（約10カラム容量）。
4. バッファーA（イミダゾールなし）とバッファーB（250 mMイミダゾール）を使用してHisタグタンパク質をグラジエント溶出します。注意：タンパク質溶出のピークは、25〜45 mMイミダゾールの範囲と予想されます。cOmplete Hisタグ精製レジンの特異性により、約25 mMですでに溶出されます。：注意レジンから目的タンパク質を効率的に遊離させるために必要な溶出バッファー中のイミダゾール量は、Hisタグの長さやHisタグへのアクセス可能性によって決まります。
5. 次回の分析のために洗浄して平衡化します（「洗浄手順」を参照）。注意：精製カラムをすぐに再利用しない場合は、2カラム容量の2 Mイミダゾールでカラムを洗浄し、非特異的結合しているタンパク質を除去します。カラムを20%エタノール溶液で平衡化し、細胞増殖を防ぐために2〜8 ℃で保存します。

注記：精製結果を最適化するための技術的なアドバイスについては、「精製プロセスの最適化」と「トラブルシューティング」を参照してください。

変性条件下での精製

このドキュメントで推奨されているバッファーは、十分に確立されたものであり、特定の目的タンパク質に最適化するよう調整することもできます。
タンパク質を変性させるか、封入体を6 Mグアニジン塩酸塩または8 M尿素を含むバッファーに溶解します。
注意：緩衝液に尿素を加えると、pHが低下します。尿素添加後にNaOHでバッファーのpHを調整することが不可欠です。
注意：バッファー組成が最適でない場合は、結合容量も大幅に低下する可能性があります。
注記：最良の結果を得るには、一晩インキュベートして、変性させた目的タンパク質をより効率的にレジンに結合させます。
：注意cOmplete Hisタグ精製レジンは、以下に示すバッファーで最適に機能することが検証済みです。これ以外のバッファーでも同様に機能すると考えられますが、事前に予備試験する必要があります。
変性条件下でのクロマトグラフィーには、以下のバッファーを用意します。
バッファーC：100 mM NaH₂PO₄／10 mM Tris-HCl／8 M尿素／pH 8.0
バッファーD：100 mM NaH₂PO₄／10 mM Tris-HCl／8 M尿素／pH 6.3
バッファーE：100 mM NaH₂PO₄／10 mM Tris-HCl／8 M尿素／pH 5.9
バッファーF：100 mM NaH₂PO₄／10 mM Tris-HCl／8 M尿素／pH 4.5

1. 10カラム容量のバッファーCでカラムを平衡化します。
2. Hisタグタンパク質を含む清澄なサンプル超遠心分離やフィルターろ過等により得られたもの）を、1 mLベッド容量のレジンの場合は0.5～1 mL/分の流量でカラムにロードします。注意：レジンの詰まりを防ぐため、カラムにロードする前に不溶性物質を除去しておいてください。このレジンの結合特異性は高いため、タンパク質の結合の反応速度は他のレジンよりも遅くなります。そのため、タンパク質のロードステップでは、1 mL/分の流量を超えないようにしてください。高い体積流量でロードすると、タンパク質の収量が減少する可能性があります。
3. 吸光度（A280）がベースラインレベルになるまで、バッファーCでカラムを洗浄します（約10～20カラム容量）。
4. 10〜20カラム容量のバッファーDで洗浄します。
5. 10～20カラム容量のバッファーEで洗浄します。
6. 10～20カラム容量のバッファーFで溶出します。
7. 変性条件下で次回の分析をおこなうために、バッファーCで洗浄および平衡化するか、バッファーAで洗浄して変性剤を除去し、ネイティブ条件下で使用できるようにします。カラムをすぐに再使用しない場合は、2カラム容量の2 Mイミダゾールでカラムを洗浄します。カラムを20%エタノール溶液で平衡化し、細胞増殖を防ぐために2〜8 ℃で保存します。注記：タンパク質の溶出は、pHを段階的に下げる方法の代わりに、イミダゾール濃度をグラジエントで最大250 mMまで上げることでもできます。

精製結果を最適化するための技術的なアドバイスについては、「精製プロセスの最適化」と「トラブルシューティング」を参照してください。

バッチ精製プロトコル
バッチ精製は、変性条件下でもネイティブ条件下でも実施できます。

1. 適切な量のcOmplete Hisタグ精製レジンを目盛り付き容器または空カラムに移します。
2. 約20カラム容量のバッファーAでレジンを平衡化します。
3. 平衡化したレジンスラリーに適量の清澄なライセートを加えます。レジンとライセートの混合物を静かに回転させ、2〜8 ℃で2〜12時間シェーカー上でインキュベートします。
4. レジンとライセートの混合物を適切なサイズのカラムにロードします。
5. カラムのフロースルーを回収します。
6. 少なくとも5カラム容量のバッファーAでカラムを洗浄します。
7. 少なくとも5カラム容量のバッファーBでタンパク質を溶出します。
8. 次回の分析のために、バッファーAで洗浄し平衡化します。注意：カラムをすぐに再利用しない場合は、カラムを20%エタノール溶液で平衡化し、細胞増殖を防ぐために2〜8 ℃で保存します。

注記：精製結果を最適化するための技術的なアドバイスについては、「精製プロセスの最適化」と「トラブルシューティング」を参照してください。

洗浄手順

cOmplete Hisタグ精製レジンは、結合能を失うことなく複数回使用することができます。ただし、時間の経過とともに、タンパク質の凝集体が蓄積し、レジンの効率が低下する可能性があります。この状況は、流量の低下や背圧の上昇によりわかります。洗浄により、レジンをさらに効率的に使用できるよう凝集体を除去します。実施できる洗浄手順は、レジンの用途によって異なります。洗浄手順が完了したら、レジンを20%エタノールに移す必要があります。

ストリンジェントなネイティブ洗浄

この方法は、非凝集タンパク質を精製している場合、および同じタンパク質を精製するためにカラムを再利用する場合に適しています。

• 10カラム容量の1 Mイミダゾール／HCl、pH 7.5で洗浄します。
• 10カラム容量の4 Mイミダゾール／HCl、pH 7.5で洗浄します。
• カラムを結合バッファーで平衡化して次の精製ラウンドに進むか、レジンを20%エタノールに移します。

SDSによる変性洗浄

この方法は、凝集したタンパク質や脂質を除去するのに適しています。
この洗浄手順は2-8℃ではなく、SDSの溶解度がより向上する15〜25 ℃で実施する必要があります。
注：SDSバッファーには50 mM DTTを添加する場合もあります。
注意：SDSと沈殿物を形成することを防ぐため、このバッファーではK+を使用することは避けてください。

• 10カラム容量の1 Mイミダゾール／HCl、pH 7.5で洗浄します。
• 10カラム容量の1 Mイミダゾール／HCl、pH 7.5、20%エタノール、2〜4% SDSで2回洗浄します。
• 10カラム容量の20%エタノールで3回洗浄しSDSを除去します。

グアニジン塩酸塩による変性洗浄
この方法は、凝集したタンパク質を除去するのに適しています。
グアニジン塩酸塩バッファーには50 mM DTTを添加する場合もあります。

• 10カラム容量の1 Mイミダゾール／HCl、pH 7.5で洗浄します。
• 10カラム容量の6 Mグアニジン塩酸塩、1 Mイミダゾール、pH 7.5で2回洗浄します。
• 10カラム容量の20%エタノールで2回洗浄します。

一般的に、どの洗浄方法を選択するかはタンパク質の種類によります。
注記：グアニジン塩酸塩を使用した変性洗浄は、SDSを使用した場合よりも制約が少なくなります。

精製プロセスの最適化

タンパク質の収量と純度を最大化するパラメータは、標的タンパク質の特性に応じて大幅に異なる場合があります。最良の結果を得るには、小規模の精製で主要パラメータを最適化します。最も純度の高いタンパク質を得るためにタンパク質精製手法を最適化するには、目的タンパク質に対するレジンの最適な使用条件を決定します。タンパク質の純度と収量はいずれも、結合に使用されるcOmplete Hisタグ精製レジンの量に依存します。レジンの量が目的タンパク質の量に対して多すぎると、レジン上の残りの結合部位が、ライセート成分のバックグラウンド結合の原因になる場合があります。レジンの量が少なすぎると、レジンの結合能がすべての目的タンパク質を結合するのに十分ではなく、タンパク質の収量が最適ではなくなります。最適な結果が得られるのは、マトリックスの容量と目的タンパク質の量が一致する場合です。目的タンパク質に対するレジンの容量は、タンパク質のサイズ、構造、多量体化の状態、Hisタグの長さとアクセス可能性、Hisタグタンパク質の発現レベルと溶解度、ライセート濃度に加え、バッファーのpHと組成などの要因によって決まります。最良の結果を得るには、目的タンパク質の精製に必要なレジンの最適な量を決定します。タンパク質の発現量とライセートの量に基づいて、次の予備試験によりレジンの最適な量を決定します。

• 並行実験の形式で、少量のレジンをさまざまな量のライセートと共にインキュベートします。
• レジンを洗浄し、結合したタンパク質を溶出します。
• 非結合画分と溶出液中の目的タンパク質の量をSDS-PAGEで判定します。
• ライセート量／レジン量の比率が最適になるのは、フロースルーにごく少量の目的タンパク質が残り、溶出画分に最大量の目的タンパク質が認められる場合です。

たとえば、20〜40 mgのT7 RNAポリメラーゼ（97 kDa）を精製する場合、必要なレジンの量は1 mLです。
注記：タンパク質がレジンに結合する時間を長くすることで、目的タンパク質の収量を最適化できます。これは、クロマトグラフィー精製のローディングステップ中に流量を下げることで実施できます。またバッチ精製時の吸着ステップは、最大12時間まではタンパク質に影響を与えることなく実施できます。たとえば、His6タグ付きT4遺伝子32タンパク質の吸着は、ローラー上のチューブ内でcOmplete Hisタグ精製レジンとタンパク質溶液を異なる時間インキュベートして検討されました。
注記：結合、洗浄、溶出の各ステップにおけるイミダゾールの最適濃度も、一定のレジン量を用いた比較試験で決定できます。この方法により、さまざまな濃度のイミダゾールを使用して、一定量のレジンを飽和させるためのライセートの最適量が特定されます。
最適な結果は、通常、pH 8.0で高塩濃度（300 mM）のバッファーで得られます(ただし目的タンパク質がこの条件に適合できる場合)。

トラブルシューティング

問題、考えられる原因、推奨事項

ベッドレジンに気泡が生じる：

• 保存バッファー（20%エタノール）と水性バッファーの混合。a）2〜8 ℃で保存した後、カラムを15〜25 ℃にもどします。b）カラムを平衡化する前に、バッファーを脱気します。

サンプルがカラム内をスムーズに流れない（低流量または高背圧）：

• ライセートの粒子がカラムに詰まっている可能性があります。a）カラムにロードする前に、サンプルを遠心分離または超遠心分離します。b）流量を下げます。c）変性洗浄手順でカラムを洗浄します。

カラム内レジンへの目的タンパク質の非効率的な結合：

• 結合ステップのバッファー条件が最適ではありません。イミダゾール濃度を下げるかpHを上げる、またはその両方をおこないます。
• インキュベーション時間が短すぎます。a）インキュベーション時間を延長します。b）結合中の流量を下げます。
• Hisタグにアクセスできません。a）Hisタグの位置を変更します。b）より長いHisタグを使用します。

目的タンパク質の溶出が非効率または起こらない：

• 目的タンパク質が多量体化し、レジンにより強く結合しています。溶出時のイミダゾール濃度を上げます。
• タンパク質が溶出前に樹脂に沈殿している。a）イオン強度を上げて、等電点沈殿を最小限に抑えます。b）変性条件下で溶出します。
• 目的タンパク質がpHシフト溶出時に沈殿している。代わりにイミダゾールで溶出してください。

目的タンパク質の回収率が低すぎる：

• 目的タンパク質が分解されている可能性があります。a）細胞溶解中に分解が起こっている場合は、プロテアーゼ阻害剤をサンプルに加えます。b）タンパク質分解は、2〜8 ℃で作業することによっても防ぐことができます。
  
• Hisタグにアクセスできない可能性があります。a）より長いHisタグを使用します。b）目的タンパク質にHisタグが含まれているかどうかを確認します。c）発現条件とバッファーを最適化します。d）Hisタグの位置を変更します。
• Hisタグがプロテアーゼによって消化されている可能性があります。a）別の発現宿主に変更します。b）プロテアーゼ阻害剤を使用します。
• 目的タンパク質が可溶性でない可能性があります。a）発現温度、発現強度、および誘導時間を低くします。b）変性条件下で精製します。c）可溶性を高める融合タンパク質を付加します。
• レジンの不足。Hisタグタンパク質の発現量がカラム内のレジン量に比例していることを確認します。

目的タンパク質が不純物とともに溶出する：

• 宿主のタンパク質がレジンと相互作用している。a）イミダゾール濃度を上げる／pHを下げることにより、ローディングおよび洗浄ステップ時のストリンジェンシーを高めます。b）サンプルの量を増やします。c）ストリンジェントなバッファーでカラムを洗浄します。
• DNAまたはRNA、あるいはその両方の混入。a）変性条件下で精製します。b）ライセートをカラムに添加する前に、DNase I消化ステップやPolymin Pによる沈殿ステップ、もしくはその両方をおこなう。

目的タンパク質が細胞溶解中または溶解後に分解されている：

• プロテアーゼからの保護が不十分。a）プロテアーゼ阻害剤をバッファーまたは培養液、あるいはその両方に添加します。b）実験ワークフローを最適化します。c）氷上でのみ作業します。
  

目的タンパク質が宿主細胞内で分解されている：

• a）プロテアーゼ欠損株を使用します。b）誘導時間を短縮します。