Prestige Antibodies^® 免疫蛍光染色プロトコル

ICC-IFプロトコル

Prestige Antibodies^®は、以下に説明するプロトコルを用いた免疫細胞染色（ICC）－免疫蛍光染色（IF）による細胞内局在性の研究に使用されています。一次抗体に加えて、核染色用のDAPIと同様に微小管に対する抗体ベースのマーカーなど、一連の細胞小器官標識マーカーが各画像に使用されています。

サンプル調製

洗浄はすべて室温で行います。

1. 細胞培養と高解像度蛍光画像処理に適したマルチウェルガラスボトムプレートを、フィブロネクチン（12.5 μg/mL濃度）により室温で1時間コーティングします。
2. 細胞を播種（1ウェルあたり10,000～25,000細胞）してから、5.0% CO₂、37℃の加湿空気中で20～24時間インキュベートします。

免疫染色

1. 培養培地を除去してから、PBS（8.1 mM Na₂HPO₄、1.5 mM KH₂PO₄、137 mM NaCl、2.7 mM KCl、pH 7.2）で細胞を洗浄します。
2. PBSで調製した4%パラホルムアルデヒド中で細胞を15分間固定します。
3. 0.1% Triton X-100のPBSにより細胞を10分間透過処理します。
4. 細胞をPBSで1回洗浄してから、非特異的部位をブロックするためにブロッキングバッファー（4% FBS含有PBS）で細胞を室温で1時間インキュベートします。
5. ブロッキングバッファーで希釈した一次抗体で細胞を4℃で一晩インキュベートします。
6. 翌日、細胞のPBSでの10分間の洗浄を4回繰り返してから、ブロッキングバッファーで希釈した二次抗体で細胞を室温で1.5時間インキュベートします。
   注記：二次抗体は蛍光標識されているため、光に反応します。サンプルは、以降の各ステップを含めて薄暗い環境に置いておく必要があります。
7. 1 ug/mLの核染色用DAPIを含むPBSにより、細胞を5分間対比染色します。
8. 細胞のPBSでの10分間の洗浄を4回繰り返してから、0.02%（w/v）NaN₃を含むPBSに細胞を封入します。

一次抗体：

• 一次抗体の一般的な使用濃度は1～4 μg/mLです。
  注記：一次抗体の希釈倍率は、あくまでガイドラインとしてご参照ください。最適な希釈倍率は、予備実験を経てご自身で決定してください。
• ポリクローナル抗体の例：500倍に希釈したマウス抗αチューブリンモノクローナル抗体（T9026）。
• モノクローナル抗体の例：500倍に希釈したマウス抗αチューブリンモノクローナル抗体 クローンDM1A（T9026）。

二次抗体：

抗ウサギIgGおよび抗マウスIgG蛍光標識二次抗体。