17-10143
LentiBrite RFP-LC3 レンチウイルスバイオセンサー
別名:
Microtubule-associated proteins 1A/1B light chain 3, Autophagy-related protein LC3, Autophagy-related ubiquitin-like modifier LC3, MAP1A/MAP1B light chain 3, Microtubule-associated protein 1 light chain 3
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About This Item
UNSPSCコード:
12352207
eCl@ss:
34360190
NACRES:
NA.32
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詳細
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Nature Methodsでメルクのアプリケーションノートをお読みください！
http://www.nature.com/app_notes/nmeth/2012/121007/pdf/an8620.pdf
（ここをクリック！）
メルクのLentiBriteレンチウイルスバイオセンサーの優位性について詳細をご確認ください！ここをクリック
バイオセンサーは、生きた状態の細胞に特定のタンパク質が含まれるかどうかを検出するだけでなく、そのタンパク質の細胞内部位を検出するためにも使用できます。細胞内目標タンパク質を可視化するための手法としては、蛍光顕微鏡検査あるいは低速度撮影ビデオキャプチャのいずれにおいても蛍光標識がよく用いられます。生細胞を破壊せずに可視化できれば、研究者はリアルタイムで細胞の状態を観察できるようになります。
レンチウイルスベクターシステムは、遺伝子産物を細胞に導入するために幅広く使用されている研究用ツールです。レンチウイルストランスフェクションは、化学に基づくトランスフェクションなどの非ウイルス的な手法、例えば分裂／非分裂細胞の高効率トランスフェクション、導入遺伝子の長期安定発現、および低免疫原性などよりも優れています。
EMD Milliporeは、LentiBriteレンチウイルスバイオセンサーをご紹介しています。これは、生細胞およびin vitro分析においてさまざまな細胞／疾患状態下で可視化を行うための、オートファジー、アポトーシス、および細胞構造に関連する重要で基本的なタンパク質をコードするパッケージ済みのレンチウイルス粒子製品群です。
EMD Millipore’のLentiBrite RFP-LC3 レンチウイルス粒子では明るい蛍光と正確な位置決定が得られ、トランスフェクトが困難な細胞タイプにおけるオートファジーの生細胞分析が行えます。
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Nature Methodsでメルクのアプリケーションノートをお読みください！
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バイオセンサーは、生きた状態の細胞に特定のタンパク質が含まれるかどうかを検出するだけでなく、そのタンパク質の細胞内部位を検出するためにも使用できます。細胞内目標タンパク質を可視化するための手法としては、蛍光顕微鏡検査あるいは低速度撮影ビデオキャプチャのいずれにおいても蛍光標識がよく用いられます。生細胞を破壊せずに可視化できれば、研究者はリアルタイムで細胞の状態を観察できるようになります。
レンチウイルスベクターシステムは、遺伝子産物を細胞に導入するために幅広く使用されている研究用ツールです。レンチウイルストランスフェクションは、化学に基づくトランスフェクションなどの非ウイルス的な手法、例えば分裂／非分裂細胞の高効率トランスフェクション、導入遺伝子の長期安定発現、および低免疫原性などよりも優れています。
EMD Milliporeは、LentiBriteレンチウイルスバイオセンサーをご紹介しています。これは、生細胞およびin vitro分析においてさまざまな細胞／疾患状態下で可視化を行うための、オートファジー、アポトーシス、および細胞構造に関連する重要で基本的なタンパク質をコードするパッケージ済みのレンチウイルス粒子製品群です。
- パッケージ済み、GFP&、RFPを用いた蛍光タグ付き
- 従来の化学ベースのトランスフェクション法やその他のウイルス以外のトランスフェクション法と比較してトランスフェクション効率が高い
- 分裂細胞、非分裂細胞、および初代細胞または幹細胞などのトランスフェクションが困難な細胞にもトランスフェクト可能
- 細胞機能を破壊しない
EMD Millipore’のLentiBrite RFP-LC3 レンチウイルス粒子では明るい蛍光と正確な位置決定が得られ、トランスフェクトが困難な細胞タイプにおけるオートファジーの生細胞分析が行えます。
オートファジーは、ストレス下にある細胞にリサイクルされた栄養素を供給する分解性経路であり、癌、神経変性、感染症など多くの疾患において、保護的役割と有害作用の両方を担っています。 LC3 ファミリーのメンバーは、オートファジーの中心的小器官であるオートファゴソームの成熟に重要な役割を果たしています。 LC3 前駆物質は細胞質ゾルに広く分布し、タンパク質分解によって LC3-I を形成します。オートファジーが始まると、Atg5-Atg12 によってホスファチジルエタノールアミンが付加され、C 末端のグリシンが LC3-II に変換されます。 LC3-II は新生オートファゴソームへ速やかに移動し、点状に分布します。 LC3 と融合した蛍光タンパク質をコードする DNA コンストラクトは、蛍光顕微鏡でオートファゴソーム形成をモニターするために、細胞への導入に広く採用されています。
EMD Millipore’のLentiBrite RFP-LC3 レンチウイルス粒子では、明るい蛍光と正確な位置決定が得られ、トランスフェクトが困難な細胞タイプでオートファジーの生細胞分析が行えます。
EMD Millipore’のLentiBrite RFP-LC3 レンチウイルス粒子では、明るい蛍光と正確な位置決定が得られ、トランスフェクトが困難な細胞タイプでオートファジーの生細胞分析が行えます。
アプリケーション
蛍光顕微鏡検査
画像処理：
（データシートの図1を参照）
初代細胞タイプあるヒト間葉系幹細胞（HuMSC）をチャンパースライドに塗布し、レンチウイルス粒子を用いて 20 の MOI で 24 時間かけて導入を行いました。 培地を交換し、さらに 48 時間培養した後、細胞は完全培地に放置するか、リソソーム阻害剤を添加した EBSS 中で 4 時間培養し、オートファジーを誘導し、オートファゴソームのリソソーム分解を阻害しました。
細胞はホルムアルデヒドで固定し、マウントしました。 画像撮影は、油浸広視野蛍光顕微鏡により行いました。 RFP-LC3 は、摂食細胞では細胞質に拡散した分布を示し、飢餓状態のオートファジー細胞では点状の分布を示します。
免疫細胞化学的比較および阻害剤分析：
（データシートの図2参照）
図 1 と同様に、HeLa 細胞をチャンバースライドにプレーティングし、MOI＝40 で 24 時間レンチウイルス粒子を形質導入しました。 培地を交換し、さらに 48 時間培養した後、細胞は完全培地に放置するか、オートファジーを誘導しリソソーム分解を阻害するためにリソソーム阻害剤を添加した EBSS 中で 4 時間インキュベートするか、あるいはオートファジーの阻害剤として 5 mM 3-メチルアデニン（3-MA）を添加してそのままインキュベートしました。 3-MA は RFP-LC3 陽性オートファジー点形成を完全にブロックします。 LC3A に対するモノクローナル抗体を用いた同じ視野の免疫細胞染色（緑）から、RFPタンパク質（赤）と同様な発現パターンを示すことが示されています。
トランスフェクションが困難な細胞タイプ：
（データシートの図3を参照）
初代細胞タイプ HUVEC をチャンパースライドに塗布し、レンチウイルス粒子を用いて20のMOIで24時間かけて導入を行いました。 完全培地に放置した細胞、またはリソソーム阻害剤を添加した EBSS でインキュベートした細胞に対するその後の処理は、図 1A および 1B のように行いました。
共焦点顕微鏡イメージング：
（データシートの図 4 参照）
HeLa細胞は図 1A および 1B のように処理しました。 画像撮影は、油浸共焦点蛍光顕微鏡により行いました。
その他の細胞タイプ：
（データシートの図 5 を参照）
HT1080 細胞を、図 1A および図 1B のように処理しました。
蛍光強度は時間とともに弱くなるため、特にトランスフェクションが困難な細胞株で最適な蛍光画像を得るには、トランスフェクション／インフェクションから24～48時間後に標的発現レベルを分析することが推奨され、これにより最適な生細胞分析が得られます。感染細胞は、トランスフェクション／インフェクションが正常終了したら凍らせて、さらに培養液中で融解すれば、24～48時間が経過しても陽性蛍光発現が維持されます。 蛍光発現の長さと強度は、細胞株によって異なります。トランスフェクションが困難な細胞株には、より高いMOIが必要になる場合があります。
画像処理：
（データシートの図1を参照）
初代細胞タイプあるヒト間葉系幹細胞（HuMSC）をチャンパースライドに塗布し、レンチウイルス粒子を用いて 20 の MOI で 24 時間かけて導入を行いました。 培地を交換し、さらに 48 時間培養した後、細胞は完全培地に放置するか、リソソーム阻害剤を添加した EBSS 中で 4 時間培養し、オートファジーを誘導し、オートファゴソームのリソソーム分解を阻害しました。
細胞はホルムアルデヒドで固定し、マウントしました。 画像撮影は、油浸広視野蛍光顕微鏡により行いました。 RFP-LC3 は、摂食細胞では細胞質に拡散した分布を示し、飢餓状態のオートファジー細胞では点状の分布を示します。
免疫細胞化学的比較および阻害剤分析：
（データシートの図2参照）
図 1 と同様に、HeLa 細胞をチャンバースライドにプレーティングし、MOI＝40 で 24 時間レンチウイルス粒子を形質導入しました。 培地を交換し、さらに 48 時間培養した後、細胞は完全培地に放置するか、オートファジーを誘導しリソソーム分解を阻害するためにリソソーム阻害剤を添加した EBSS 中で 4 時間インキュベートするか、あるいはオートファジーの阻害剤として 5 mM 3-メチルアデニン（3-MA）を添加してそのままインキュベートしました。 3-MA は RFP-LC3 陽性オートファジー点形成を完全にブロックします。 LC3A に対するモノクローナル抗体を用いた同じ視野の免疫細胞染色（緑）から、RFPタンパク質（赤）と同様な発現パターンを示すことが示されています。
トランスフェクションが困難な細胞タイプ：
（データシートの図3を参照）
初代細胞タイプ HUVEC をチャンパースライドに塗布し、レンチウイルス粒子を用いて20のMOIで24時間かけて導入を行いました。 完全培地に放置した細胞、またはリソソーム阻害剤を添加した EBSS でインキュベートした細胞に対するその後の処理は、図 1A および 1B のように行いました。
共焦点顕微鏡イメージング：
（データシートの図 4 参照）
HeLa細胞は図 1A および 1B のように処理しました。 画像撮影は、油浸共焦点蛍光顕微鏡により行いました。
その他の細胞タイプ：
（データシートの図 5 を参照）
HT1080 細胞を、図 1A および図 1B のように処理しました。
蛍光強度は時間とともに弱くなるため、特にトランスフェクションが困難な細胞株で最適な蛍光画像を得るには、トランスフェクション／インフェクションから24～48時間後に標的発現レベルを分析することが推奨され、これにより最適な生細胞分析が得られます。感染細胞は、トランスフェクション／インフェクションが正常終了したら凍らせて、さらに培養液中で融解すれば、24～48時間が経過しても陽性蛍光発現が維持されます。 蛍光発現の長さと強度は、細胞株によって異なります。トランスフェクションが困難な細胞株には、より高いMOIが必要になる場合があります。
構成
TagRFP-LC3 レンチウイルス：
1バイアルに、1 mLあたり少なくとも3 x 10E8感染単位（IFU）のレンチウイルス粒子を25 µL含む。
ロットに固有の力価情報については、上記製品ボックスの“ウイルス力価”をご覧ください。
プロモーター
EF-1（伸長因子-1）
感染多重度（MOI）
MOI = 感染させた細胞数に対する感染性レンチウイルス粒子数（IFU）の比
高い形質導入効率およびシグナル強度を達成するための典型的なMOI値は、20～40の範囲です。 この標的の場合、細胞種によっては低いMOI（例：HT-1080、HeLa）が必要な場合もあれば、高いMOI（例：ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）、U2OS、ヒト間葉系幹細胞（HuMSC））が必要な場合もあります。
注：必要な導入効率とシグナル強度が得られるように、MOI値は各細胞タイプとレンチウイルス標的ごとにご自身で決定して最適化してください。
1バイアルに、1 mLあたり少なくとも3 x 10E8感染単位（IFU）のレンチウイルス粒子を25 µL含む。
ロットに固有の力価情報については、上記製品ボックスの“ウイルス力価”をご覧ください。
プロモーター
EF-1（伸長因子-1）
感染多重度（MOI）
MOI = 感染させた細胞数に対する感染性レンチウイルス粒子数（IFU）の比
高い形質導入効率およびシグナル強度を達成するための典型的なMOI値は、20～40の範囲です。 この標的の場合、細胞種によっては低いMOI（例：HT-1080、HeLa）が必要な場合もあれば、高いMOI（例：ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）、U2OS、ヒト間葉系幹細胞（HuMSC））が必要な場合もあります。
注：必要な導入効率とシグナル強度が得られるように、MOI値は各細胞タイプとレンチウイルス標的ごとにご自身で決定して最適化してください。
品質
MOI 値 20 および 40 で HT-1080 細胞を形質導入して評価。 蛍光イメージングによる標的局在化および形質導入効率の評価。
法的情報
CHEMICON is a registered trademark of Merck KGaA, Darmstadt, Germany
保管分類コード
10 - Combustible liquids
WGK
WGK 2
適用法令
試験研究用途を考慮した関連法令を主に挙げております。化学物質以外については、一部の情報のみ提供しています。 製品を安全かつ合法的に使用することは、使用者の義務です。最新情報により修正される場合があります。WEBの反映には時間を要することがあるため、適宜SDSをご参照ください。
Jan Code
17-10143:
試験成績書（COA）
製品のロット番号・バッチ番号を入力して、試験成績書（COA） を検索できます。ロット番号・バッチ番号は、製品ラベルに「Lot」または「Batch」に続いて記載されています。
資料
High titer lentiviral particles for LC3 variants used for live cell analysis of cellular autophagy.
ライフサイエンス、有機合成、材料科学、クロマトグラフィー、分析など、あらゆる分野の研究に経験のあるメンバーがおります。.
製品に関するお問い合わせはこちら（テクニカルサービス）