S7150
Kit OxyBlot™ per la rivelazione dell'ossidazione proteica
The OxyBlot Protein Oxidation Detection Kit provides the reagents to perform the immunoblot detection of carbonyl groups introduced into proteins by oxidative reactions with ozone or oxides of nitrogen or by metal catalyzed oxidation.
Sinonimo/i:
OxyBlot assay, Protein oxidation kit
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About This Item
Codice UNSPSC:
12161503
eCl@ss:
32161000
NACRES:
NA.84
Prodotti consigliati
Livello qualitativo
Produttore/marchio commerciale
Chemicon®
OxyBlot
tecniche
western blot: suitable
Metodo di rivelazione
chemiluminescent
Condizioni di spedizione
wet ice
Descrizione generale
La modifica ossidativa delle proteine da parte dei radicali liberi dell'ossigeno e di altre specie reattive si verifica sia nei processi fisiologici che in quelli patologici. In conseguenza di tale modifica, attraverso un meccanismo sito-specifico, vengono introdotti nelle catene laterali delle proteine dei gruppi carbonilici . Il kit OxyBlot fornisce reagenti per l′immunorilevazione semplice e sensibile della presenza di tali gruppi che rappresentano un segno distintivo dello stato di ossidazione delle proteine.
Applicazioni
Preparazione del lisato cellulare
1. Lavare le cellule aderenti nella piastra/fiasca con PBS freddo per due volte, eliminare il PBS. Per cellule non aderenti fare un lavaggio in PBS e centrifugare a 800-1000 giri/min per 5 min in una centrifuga da tavolo per ottenere il pellet di cellule.
2. Aggiungere alle cellule il tampone RIPA freddo (1 ml per 10^7 cellule/piastra da 100 mm/fiasca da 150 cm^2; 0,5 ml per 5 x 10^6 cellule/piastra da 60 mm/fiasca da 75 cm^2).
3. Raschiare le cellule aderenti dalla piastra/fiasca con un spatolina in gomma o un raschietto di plastica per cellule raffreddati in acqua distillata ghiacciata. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta centrifuga. Agitare delicatamente la sospensione su un agitatore basculante o su un agitatore orbitale nella stanza fredda per 15 minuti per lisare le cellule.
4. Centrifugare il lisato a 14.000 x g in una centrifuga pre-raffreddata per 15 minuti. Trasferire immediatamente il soprannatante in una nuova provetta da centrifuga, buttare il pellet.
5. Diluire il lisato cellulare almeno 1:10 prima della misurazione della concentrazione proteica (i detergenti contenuti nel tampone di lisi potrebbero infatti interferire con il reagente a base di Coomassie) A questo punto il campione può essere diviso in aliquote e conservato a -20¡C per al massimo un mese.
SUGGERIMENTO: Quando si lavora con grandi volumi di cellule non aderenti, potrebbe non essere possibile raffreddare rapidamente le cellule per mantenere l'attività della proteina in esame. In questo caso, aggiungere la sospensione cellulare a una miscela di uguale massa di PBS 2X e ghiaccio, poi raccogliere le cellule per centrifugazione e procedere alla lisi come descritto sopra.
Tampone RIPA per la lisi cellulare:
N. Cat. 20-188
http://www.millipore.com/catalogue/item/20-188
L'agente riducente è molto importante per prevenire l'ossidazione:
Il lisato proteico può essere preparato seguendo diversi protocolli. Sono adatti anche i tamponi standard come RIPA e Triton. Si raccomanda di aggiungere al tampone di lisi un agente riducente per prevenire l'ossidazione delle proteine che potrebbe verificarsi dopo la lisi cellulare. Un tampone di lisi contenente 1-2% di 2-mercaptoetanolo o 50 mM di DTT è in grado di inibire sufficientemente l′ossidazione senza inibire la reazione di derivatizzazione nel protocollo OxyBlot. Anche i campioni di proteine purificate possono essere analizzati con il Kit OxyBlot.
Per informazioni generali sull'estrazione delle proteine, si prega di consultare questo link.
http://www.millipore.com/immunodetection/id3/proteinextraction
1. Lavare le cellule aderenti nella piastra/fiasca con PBS freddo per due volte, eliminare il PBS. Per cellule non aderenti fare un lavaggio in PBS e centrifugare a 800-1000 giri/min per 5 min in una centrifuga da tavolo per ottenere il pellet di cellule.
2. Aggiungere alle cellule il tampone RIPA freddo (1 ml per 10^7 cellule/piastra da 100 mm/fiasca da 150 cm^2; 0,5 ml per 5 x 10^6 cellule/piastra da 60 mm/fiasca da 75 cm^2).
3. Raschiare le cellule aderenti dalla piastra/fiasca con un spatolina in gomma o un raschietto di plastica per cellule raffreddati in acqua distillata ghiacciata. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta centrifuga. Agitare delicatamente la sospensione su un agitatore basculante o su un agitatore orbitale nella stanza fredda per 15 minuti per lisare le cellule.
4. Centrifugare il lisato a 14.000 x g in una centrifuga pre-raffreddata per 15 minuti. Trasferire immediatamente il soprannatante in una nuova provetta da centrifuga, buttare il pellet.
5. Diluire il lisato cellulare almeno 1:10 prima della misurazione della concentrazione proteica (i detergenti contenuti nel tampone di lisi potrebbero infatti interferire con il reagente a base di Coomassie) A questo punto il campione può essere diviso in aliquote e conservato a -20¡C per al massimo un mese.
SUGGERIMENTO: Quando si lavora con grandi volumi di cellule non aderenti, potrebbe non essere possibile raffreddare rapidamente le cellule per mantenere l'attività della proteina in esame. In questo caso, aggiungere la sospensione cellulare a una miscela di uguale massa di PBS 2X e ghiaccio, poi raccogliere le cellule per centrifugazione e procedere alla lisi come descritto sopra.
Tampone RIPA per la lisi cellulare:
N. Cat. 20-188
http://www.millipore.com/catalogue/item/20-188
L'agente riducente è molto importante per prevenire l'ossidazione:
Il lisato proteico può essere preparato seguendo diversi protocolli. Sono adatti anche i tamponi standard come RIPA e Triton. Si raccomanda di aggiungere al tampone di lisi un agente riducente per prevenire l'ossidazione delle proteine che potrebbe verificarsi dopo la lisi cellulare. Un tampone di lisi contenente 1-2% di 2-mercaptoetanolo o 50 mM di DTT è in grado di inibire sufficientemente l′ossidazione senza inibire la reazione di derivatizzazione nel protocollo OxyBlot. Anche i campioni di proteine purificate possono essere analizzati con il Kit OxyBlot.
Per informazioni generali sull'estrazione delle proteine, si prega di consultare questo link.
http://www.millipore.com/immunodetection/id3/proteinextraction
Preparazione del lisato cellulare
1. Lavare le cellule aderenti nella piastra/fiasca con PBS freddo per due volte, eliminare il PBS. Per cellule non aderenti fare un lavaggio in PBS e centrifugare a 800-1000 giri/min per 5 min in una centrifuga da tavolo per ottenere il pellet di cellule.
2. Aggiungere alle cellule il tampone RIPA freddo (1 ml per 10^7 cellule/piastra da 100 mm/fiasca da 150 cm^2; 0,5 ml per 5 x 10^6 cellule/piastra da 60 mm/fiasca da 75 cm^2).
3. Raschiare le cellule aderenti dalla piastra/fiasca con un spatolina in gomma o un raschietto di plastica per cellule raffreddati in acqua distillata ghiacciata. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta centrifuga. Agitare delicatamente la sospensione su un agitatore basculante o su un agitatore orbitale nella stanza fredda per 15 minuti per lisare le cellule.
4. Centrifugare il lisato a 14.000 x g in una centrifuga pre-raffreddata per 15 minuti. Trasferire immediatamente il soprannatante in una nuova provetta da centrifuga, buttare il pellet.
5. Diluire il lisato cellulare almeno 1:10 prima della misurazione della concentrazione proteica (i detergenti contenuti nel tampone di lisi potrebbero infatti, se troppo concentrati, interferire con il reagente a base di Coomassie) A questo punto il campione può essere diviso in aliquote e conservato a -20¡C per al massimo un mese.
SUGGERIMENTO: Quando si lavora con grandi volumi di cellule non aderenti, potrebbe non essere possibile raffreddare rapidamente le cellule per mantenere l'attività della proteina in esame. In questo caso, aggiungere la sospensione cellulare a una miscela di uguale massa di PBS 2X e ghiaccio, poi raccogliere le cellule per centrifugazione e procedere alla lisi come descritto sopra.
Tampone RIPA per la lisi cellulare:
N. Cat. 20-188
http://www.millipore.com/catalogue/item/20-188
L'agente riducente è molto importante per prevenire l'ossidazione:
Il lisato proteico può essere preparato seguendo diversi protocolli. Sono adatti anche i tamponi standard come RIPA e Triton. Si raccomanda di aggiungere al tampone di lisi un agente riducente per prevenire l'ossidazione delle proteine che potrebbe verificarsi dopo la lisi cellulare. Un tampone di lisi contenente 1-2% di 2-mercaptoetanolo o 50 mM di DTT è in grado di inibire sufficientemente l′ossidazione senza inibire la reazione di derivatizzazione nel protocollo OxyBlot. Anche i campioni di proteine purificate possono essere analizzati con il Kit OxyBlot.
Per informazioni generali sull'estrazione delle proteine, si prega di consultare questo link.
http://www.millipore.com/immunodetection/id3/proteinextraction
1. Lavare le cellule aderenti nella piastra/fiasca con PBS freddo per due volte, eliminare il PBS. Per cellule non aderenti fare un lavaggio in PBS e centrifugare a 800-1000 giri/min per 5 min in una centrifuga da tavolo per ottenere il pellet di cellule.
2. Aggiungere alle cellule il tampone RIPA freddo (1 ml per 10^7 cellule/piastra da 100 mm/fiasca da 150 cm^2; 0,5 ml per 5 x 10^6 cellule/piastra da 60 mm/fiasca da 75 cm^2).
3. Raschiare le cellule aderenti dalla piastra/fiasca con un spatolina in gomma o un raschietto di plastica per cellule raffreddati in acqua distillata ghiacciata. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta centrifuga. Agitare delicatamente la sospensione su un agitatore basculante o su un agitatore orbitale nella stanza fredda per 15 minuti per lisare le cellule.
4. Centrifugare il lisato a 14.000 x g in una centrifuga pre-raffreddata per 15 minuti. Trasferire immediatamente il soprannatante in una nuova provetta da centrifuga, buttare il pellet.
5. Diluire il lisato cellulare almeno 1:10 prima della misurazione della concentrazione proteica (i detergenti contenuti nel tampone di lisi potrebbero infatti, se troppo concentrati, interferire con il reagente a base di Coomassie) A questo punto il campione può essere diviso in aliquote e conservato a -20¡C per al massimo un mese.
SUGGERIMENTO: Quando si lavora con grandi volumi di cellule non aderenti, potrebbe non essere possibile raffreddare rapidamente le cellule per mantenere l'attività della proteina in esame. In questo caso, aggiungere la sospensione cellulare a una miscela di uguale massa di PBS 2X e ghiaccio, poi raccogliere le cellule per centrifugazione e procedere alla lisi come descritto sopra.
Tampone RIPA per la lisi cellulare:
N. Cat. 20-188
http://www.millipore.com/catalogue/item/20-188
L'agente riducente è molto importante per prevenire l'ossidazione:
Il lisato proteico può essere preparato seguendo diversi protocolli. Sono adatti anche i tamponi standard come RIPA e Triton. Si raccomanda di aggiungere al tampone di lisi un agente riducente per prevenire l'ossidazione delle proteine che potrebbe verificarsi dopo la lisi cellulare. Un tampone di lisi contenente 1-2% di 2-mercaptoetanolo o 50 mM di DTT è in grado di inibire sufficientemente l′ossidazione senza inibire la reazione di derivatizzazione nel protocollo OxyBlot. Anche i campioni di proteine purificate possono essere analizzati con il Kit OxyBlot.
Per informazioni generali sull'estrazione delle proteine, si prega di consultare questo link.
http://www.millipore.com/immunodetection/id3/proteinextraction
Preparazione del lisato cellulare
1. Lavare le cellule aderenti nella piastra/fiasca con PBS freddo per due volte, eliminare il PBS. Per cellule non aderenti fare un lavaggio in PBS e centrifugare a 800-1000 giri/min per 5 min in una centrifuga da tavolo per ottenere il pellet di cellule.
2. Aggiungere alle cellule il tampone RIPA freddo (1 ml per 10^7 cellule/piastra da 100 mm/fiasca da 150 cm^2; 0,5 ml per 5 x 10^6 cellule/piastra da 60 mm/fiasca da 75 cm^2).
3. Raschiare le cellule aderenti dalla piastra/fiasca con un spatolina in gomma o un raschietto di plastica per cellule raffreddati in acqua distillata ghiacciata. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta centrifuga. Agitare delicatamente la sospensione su un agitatore basculante o su un agitatore orbitale nella stanza fredda per 15 minuti per lisare le cellule.
4. Centrifugare il lisato a 14.000 x g in una centrifuga pre-raffreddata per 15 minuti. Trasferire immediatamente il soprannatante in una nuova provetta da centrifuga, buttare il pellet.
5. Diluire il lisato cellulare almeno 1:10 prima della misurazione della concentrazione proteica (i detergenti contenuti nel tampone di lisi potrebbero infatti, se troppo concentrati, interferire con il reagente a base di Coomassie) A questo punto il campione può essere diviso in aliquote e conservato a -20¡C per al massimo un mese.
SUGGERIMENTO: Quando si lavora con grandi volumi di cellule non aderenti, potrebbe non essere possibile raffreddare rapidamente le cellule per mantenere l'attività della proteina in esame. In questo caso, aggiungere la sospensione cellulare a una miscela di uguale massa di PBS 2X e ghiaccio, poi raccogliere le cellule per centrifugazione e procedere alla lisi come descritto sopra.
Tampone RIPA per la lisi cellulare:
N. Cat. 20-188
http://www.millipore.com/catalogue/item/20-188
L'agente riducente è molto importante per prevenire l'ossidazione:
Il lisato proteico può essere preparato seguendo diversi protocolli. Sono adatti i classici tamponi di lisi quali RIPA e Triton. Si raccomanda di aggiungere al tampone di lisi un agente riducente per prevenire l'ossidazione delle proteine che potrebbe verificarsi in seguito alla lisi cellulare. Un tampone di lisi contenente 1-2% di 2-mercaptoetanolo o 50 mM di DTT è in grado di inibire sufficientemente l′ossidazione senza inibire la reazione di derivatizzazione nel protocollo OxyBlot. Anche i campioni di proteine purificate possono essere analizzati con il Kit OxyBlot.
Per informazioni generali sull'estrazione delle proteine, si prega di consultare questo link.
http://www.millipore.com/immunodetection/id3/proteinextraction
1. Lavare le cellule aderenti nella piastra/fiasca con PBS freddo per due volte, eliminare il PBS. Per cellule non aderenti fare un lavaggio in PBS e centrifugare a 800-1000 giri/min per 5 min in una centrifuga da tavolo per ottenere il pellet di cellule.
2. Aggiungere alle cellule il tampone RIPA freddo (1 ml per 10^7 cellule/piastra da 100 mm/fiasca da 150 cm^2; 0,5 ml per 5 x 10^6 cellule/piastra da 60 mm/fiasca da 75 cm^2).
3. Raschiare le cellule aderenti dalla piastra/fiasca con un spatolina in gomma o un raschietto di plastica per cellule raffreddati in acqua distillata ghiacciata. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta centrifuga. Agitare delicatamente la sospensione su un agitatore basculante o su un agitatore orbitale nella stanza fredda per 15 minuti per lisare le cellule.
4. Centrifugare il lisato a 14.000 x g in una centrifuga pre-raffreddata per 15 minuti. Trasferire immediatamente il soprannatante in una nuova provetta da centrifuga, buttare il pellet.
5. Diluire il lisato cellulare almeno 1:10 prima della misurazione della concentrazione proteica (i detergenti contenuti nel tampone di lisi potrebbero infatti, se troppo concentrati, interferire con il reagente a base di Coomassie) A questo punto il campione può essere diviso in aliquote e conservato a -20¡C per al massimo un mese.
SUGGERIMENTO: Quando si lavora con grandi volumi di cellule non aderenti, potrebbe non essere possibile raffreddare rapidamente le cellule per mantenere l'attività della proteina in esame. In questo caso, aggiungere la sospensione cellulare a una miscela di uguale massa di PBS 2X e ghiaccio, poi raccogliere le cellule per centrifugazione e procedere alla lisi come descritto sopra.
Tampone RIPA per la lisi cellulare:
N. Cat. 20-188
http://www.millipore.com/catalogue/item/20-188
L'agente riducente è molto importante per prevenire l'ossidazione:
Il lisato proteico può essere preparato seguendo diversi protocolli. Sono adatti i classici tamponi di lisi quali RIPA e Triton. Si raccomanda di aggiungere al tampone di lisi un agente riducente per prevenire l'ossidazione delle proteine che potrebbe verificarsi in seguito alla lisi cellulare. Un tampone di lisi contenente 1-2% di 2-mercaptoetanolo o 50 mM di DTT è in grado di inibire sufficientemente l′ossidazione senza inibire la reazione di derivatizzazione nel protocollo OxyBlot. Anche i campioni di proteine purificate possono essere analizzati con il Kit OxyBlot.
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Stoccaggio e stabilità
Conservare lo standard di proteine (componente 90450) tra -25° e -15°C, dopo il ricevimento. Conservare tutti gli altri componenti tra 2°C e 8°C.
Conservare lo standard di proteine (componente 90450) tra -25° e -15°C, dopo il ricevimento. Conservare tutti gli altri componenti tra 2°C e 8°C.
Note legali
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