Lyse & Proteinextraktion

Bei der Aufreinigung von Proteinen für Funktions- oder Strukturstudien oder für die präparative Verarbeitung und Produktion müssen zunächst die Zellen oder das Gewebe aufgeschlossen werden, um Zugang zu den Zielproteinen zu erhalten. Zelllyse und Proteinsolubilisierung sind der Schlüssel zu einer effektiven Analyse und effizienten Verarbeitung. Als Extraktionsmethoden stehen enzymatische, chemische oder mechanische oder eine Kombination hieraus zur Auswahl.

• Detergenzbasierte Lyse
• Gefrier-/Auftau-Lyse
• Osmotischer Schock
• Ultraschall
• Mechanische Methoden
• Enzymatischer Aufschluss

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Für den Zellaufschluss und die Vorbereitung von Zellbestandteilen für die Analyse stehen zahlreiche Methoden zur Verfügung. Im Allgemeinen werden schonende Methoden eingesetzt, wenn die Probe aus leicht lysierbaren kultivierten Zellen oder Blutzellen besteht, während für den Aufschluss von robusteren Bakterien- oder Pflanzenzellen oder in Bindegewebe eingebetteten Säugerzellen stärkere Methoden angewendet werden.

• Detergenzbasierte Lyse: Detergenzbasierte Lyse: Die Detergenzien-Lyse ist eine schonende Methode, die für Säugerzellen, Bakterienzellen, Hefen und Pflanzen verwendet werden kann. Die Zellsuspensionen werden vorsichtig zentrifugiert und in einer Lyse-Lösung resuspendiert, die Detergenzien enthält, welche die Zellmembran aufbrechen. Dabei werden die Membranen solubilisiert, die Zellen aufgeschlossen und ihr Inhalt freigesetzt. Detergenzien müssen unter Umständen nachgeschaltet entfernt werden, wenn sie die Analyse oder die Produktion beeinträchtigen.
• Gefrier-/Auftau-Lyse: Diese Methode ist für Säuger- oder Bakterienzellsuspensionen anwendbar. Die Zellsuspension wird unter Anwendung von Flüssigstickstoff schnell gefroren. Die Probe wird dann aufgetaut und durch Pipettieren oder schonendes Vortexen in Lysepuffer resuspendiert. Dieser Prozess wird mehrere Male wiederholt. Zwischen den Zyklen wird die Probe zentrifugiert und der Überstand mit löslichem Protein gesammelt.
• Osmotischer Schock: Diese äußerst schonende Methode kann für die Lyse suspendierter Säuger- oder Bakterienzellen ohne Verwendung eines Detergenz ausreichend sein. Diese Methode, die oftmals mit mechanischen Aufschlussmethoden kombiniert wird, beruht auf dem Wechsel von einem hochosmotischen zu einem niederosmotischen Medium und eignet sich gut für Anwendungen, bei denen das Lysat anschließend in subzelluläre Komponenten fraktioniert werden soll.
• Ultraschall: Diese Methode der Proteinextration wird am häufigsten für Zellsuspensionen eingesetzt. Die Zellen werden über eine in die Probe eingeführte Sonde durch hochfrequente Schallwellen aufgeschlossen. Die Schallwellen erzeugen einen Niederdruckbereich, durch den die Zellmembranen aufgeschlossen werden.
• Mechanische Methoden: Proteine können durch Anwendung verschiedener primitiver, jedoch effektiver Zerkleinerungs- und Mahlmethoden aus Zellen und Geweben extrahiert werden. Zellmembranen können zum Beispiel durch Flüssigkeitsscherkräfte unter Anwendung der Dounce- oder Potter-Elvehjem-Homogenisierung aufgeschlossen werden. Gewebe können durch Zerhacken oder Zerkleinern in gekühltem Puffer mithilfe eines Waring-Mixers oder Polytron® Homogenisators aufgeschlossen werden. Gewebe oder Zellen können in Flüssigstickstoff gefroren und mithilfe eines Mörsers und einer Pistille mit Tonerde oder Sand zu einem feinen Pulver zerrieben werden. Schnelles Schütteln von Zellen mit kleinen Glasperlen schließt Zellwände auf und ist für die meisten grampositiven und gramnegativen Bakterien effektiv.
• Enzymatischer Aufschluss: Enzymatischer Aufschluss: Enzymatische Methoden werden häufig zur Extraktion von Proteinen aus Bakterien, Hefen oder eukaryotischen Zellen eingesetzt, wenn diese in Fasergewebe eingebettet und die Zellmembranen durch eine robuste Struktur geschützt sind. Zelllyseenzyme oder -cocktails wie Lysozym, Mutanolysin, MetaPolyzyme, Lysonase und Pronase können in Kombination mit Enzymen für den Gewebeaufschluss (z. B. Kollagenase, Chondroitinase, Hyaluronidase) verwendet werden, um Zellwände, Hüllen, Kapseln, Kapside oder andere Strukturen aufzulösen oder aufzuschließen, die mit mechanischen Methoden allein nicht leicht zu überwinden sind. Auf den enzymatischen Aufschluss folgt oftmals eine Homogenisierung, Ultraschallbehandlung oder kräftiges Vortexen in einem Lysepuffer.

Da endogene Proteasen und Phosphatasen beim Zellaufschluss freigesetzt werden und das Zielmolekül degradieren können, sollte die Probe beim Zellaufschluss und bei der nachfolgenden Aufreinigung mithilfe von Protease- und Phosphatasehemmern geschützt werden, um einen unkontrollierten Zielmolekülverlust zu verhindern.