Proteinquantifizierung
Proteinquantifizierung und Proteinassays sind wichtig für die präzise Messung der Proteinkonzentration in einer Probe. Es gibt verschiedene Methoden zur Proteinquantifizierung wie UV-Absorptionsassays, reagenzbasierte Assays und Immunoassaytechnologien. Jede dieser Proteinquantifizierungstechnologien besitzt einzigartige Vorteile, und die Eignung eines Assays hängt vom Probentyp und/oder dem zur Verfügung stehenden Probenvolumen ab. Zum Beispiel können einige der farbstoffbasierten Assays mit Chemikalien in Pufferzubereitungen interferieren, so dass ein alternativer Assay möglicherweise besser geeignet ist. Bei der Auswahl der besten Option für eine Probe müssen Wissenschaftler die Grenzen jedes Assays berücksichtigen.
UV-Absorptionsassays
Die Anwendung von Ultraviolett(UV)-Absorption zur Bestimmung der Proteinkonzentration ist ein relativ einfacher Quantifizierungsassay. Aminosäuren mit aromatischen Seitenketten (Tryptophan, Tyrosin usw.) verleihen Proteinen ihre charakteristische UV-Absorption bei 280 nm. Da diese Aminosäuren UV-Licht bei 280 nm absorbieren, kann die Absorption bei dieser spezifischen Wellenlänge mit einem Spektralphotometer gemessen und zur Schätzung der Proteinkonzentration in Proben verwendet werden. Dieser relativ schnelle Assay wird häufig in Laboren eingesetzt. Für die Schätzung der Proteinkonzentration findet typischerweise die Warburg-Christian-Methode Anwendung. Die Nutzung der UV-Absorption zur Bestimmung der Proteinkonzentration kann jedoch eine hohe Variabilität aufweisen, da Nicht-Protein-Komponenten in einer Probe mit den Absorptionsmessungen interferieren können. Außerdem könnten Mischungen mit verschiedenen Proteinen in einer Probe aufgrund der unterschiedlichen Aminosäurezusammensetzung variable Absorptionsergebnisse verursachen.
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Reagenzbasierte Assays
Reagenzbasierte Assays überwinden die Kompatibilitätsprobleme, die bei UV-Absorptionsassays beobachtet werden. Beispiele für reagenzbasierte Assays zur Proteinquantifizierung sind kolorimetrische Methoden wie der Bicinchoninsäure(BCA)-, Lowry- und Bradford-Assay. Die BCA-Methode und die Lowry-Methode beinhalten beide die Bildung eines Kupfer-Protein-Komplexes. Diese Assays sind empfindlich und weniger variabel als der Bradford-Assay. Der Bradford-Assay ist jedoch schnell, einfach durchzuführen und im Gegensatz zum BCA- und Lowry-Assay mit bestimmten Reduktionsmitteln kompatibel.
Immunassays
Einige Assays sind u. U. nicht für eine präzise Proteinquantifizierung geeignet, wenn eine Probe mehrere Proteine enthält oder die Konzentration unterhalb der Nachweisgrenze liegt. Leistungsstarke Immunassays, die verschiedene Nachweismethoden einsetzen, bieten eine alternative Methode zur präzisen Quantifizierung von Proteinen in unterschiedlichen Probentypen. Zum Beispiel ermöglichen Multiplex-Assays die simultane Quantifizierung mehrerer Proteine in einer Probe. Des Weiteren kann die Einzelmolekül-Zähltechnik Proteinkonzentrationen im Femtogrammbereich messen, um geringe Konzentrationen in kleinen Proben zu identifizieren und zu quantifizieren. Diese Technologien finden bei Forschungsanwendungen Einsatz wie der Bestimmung von Biomarkern in gesundem Gewebe oder von Biomarkern, die mit Krankheitsprogression assoziiert sind, um ein besseres Verständnis bestimmter Krankheitszustände zu erlangen.
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