Gelelektrophorese

SDS-PAGE

Die Natriumdodecylsulfat(SDS)-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) ermöglicht die Trennung von Proteinen nach Molekülmasse. Bei dieser Methode wird dem Laufpuffer SDS-Detergenz zugegeben. Das SDS verleiht den Proteinen eine negative Ladung und maskiert ihre intrinsische Ladung. Wenn Proteine in Gegenwart von SDS und Denaturierungsmitteln getrennt werden, werden sie weniger globulär und mehr linear. Aus diesem Grund ist die Geschwindigkeit, mit der SDS-gebundene Proteine durch das Gel wandern, abhängig von ihrer Größe, sodass ihr Molekulargewicht durch Vergleich mit Proteinstandards abgeschätzt werden kann.

Native PAGE

Bei der nativen Polyacrylamid-Gelelektrophorese werden Proteine so getrennt, dass ihre native Konformation (Tertiärstruktur), die Wechselwirkungen von Untereinheiten (Quartärstruktur und Protein-Protein-Interaktionen) und ihre biologische Aktivität erhalten bleiben. Bei dieser Methode erfolgt die Vorbereitung und der Durchlauf der Proteine unter nicht-reduzierenden, nicht-denaturierenden Bedingungen. Die Proteinmobilität wird durch eine komplexe Kombination von Faktoren bestimmt, da jedes Protein abhängig von seiner Ladung auf jede der Elektroden zuwandern kann, wobei die Geschwindigkeit von seiner Form und seinem Bindungsverhalten abhängt. Aus diesem Grund wird die native PAGE nicht zur Bestimmung des Molekulargewichts empfohlen. Die native PAGE wird typischerweise in Anwendungen eingesetzt, die eine Aufreinigung von aktivem Protein oder die Detektion durch einen Antikörper, der nur die native Form des Proteins erkennt, erfordert.

Isoelektrische Fokussierung (IEF)

Bei der isoelektrischen Fokussierung wird sowohl ein elektrisches Feld als auch ein pH-Gradient eingesetzt, um Proteine nach ihrem nativen isoelektrischen Punkt (pI) zu trennen. Während Proteine durch den pH-Gradienten wandern, ändert sich ihre Nettoladung. In einem elektrischen Feld wandert jedes Protein zu dem pH-Wert, an dem seine Nettoladung Null beträgt (was als isolelektrischer Punkt des Proteins bezeichnet wird). Während des Trennverfahrens sammeln („fokussieren“) sich Proteine in der Probe an spezifischen und vorhersagbaren Stellen im Gel an. Die isoelektrische Fokussierung wird bei der Proteinidentifizierung in komplexen Proben (z. B. Zell- und Gewebelysaten, Plasma), bei der Analyse posttranslationaler Modifikationen und bei der Auftrennung von Proben für die massenspektrometrische Analyse eingesetzt.

2D-PAGE

Die zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese ermöglicht die Auflösung von Proteinen sowohl nach ihrem instrinsischen isoelektrischen Punkt (pI) als auch nach Masse. Die Trennung nach pI erfolgt durch isoelektrische Fokussierung (IEF). Die Trennung nach Masse erfolgt durch SDS-PAGE. Die 2D-PAGE bietet die beste Auflösung für die Proteinanalyse und wird häufig in der Proteomforschung zur Auftrennung hunderter bis tausender von Proteinen auf einem einzigen Gel eingesetzt.