Proteinexpression
Dank Fortschritten im Bereich der Genomik, Klonierung sowie zahlreichen molekularbiologischen Verfahren können Wissenschaftler heterologe Proteine in verschiedenen biologischen Systemen exprimieren. Die Fähigkeit, rekombinante Proteine zu exprimieren, stellt Wissenschaftlern eine breite Auswahl an leistungsstarken Downstream-Anwendungen für weiterführende Forschungsstudien bereit. Im kleinen Maßstab kann die Überexpression von Proteinen Studien zur Erforschung der Proteinfunktion unterstützen, während die Proteinproduktion im großen Maßstab für die Produktion von Enzymen, Antikörpern und Impfstoffen entscheidend ist. Die Bestimmung der optimalen Bedingungen für das Zellwachstum und die Proteinexpression ist für Proteinexpressionssysteme sowohl im kleinen als auch großen Maßstab wichtig. Unabhängig davon, ob für posttranslationale Modifikationen ein prokaryotisches oder eukaryotisches Expressionssystem erforderlich ist, werden die für die optimale Proteinexpression benötigten Werkzeuge und Reagenzien vorwiegend durch den Zelltyp bestimmt.
Zugehörige technische Artikel
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Zugehörige Protokolle
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Proteinexpressionsvektoren
Expressionsvektoren oder Plasmide sind zirkuläre DNA-Sequenzen, die Wissenschaftler häufig zur Aufnahme des Gens, das das gesuchte Protein codiert, verwenden. Plasmide, die das gesuchte Gen enthalten, werden anschließend per Transformation/Transfektion in Zellen eingebracht, die das Protein überexprimieren. Plasmide weisen verschiedene nützliche Elemente auf, die das Klonieren, die Klonauswahl sowie die Proteinexpression und -aufreinigung erleichtern. Dazu gehören u.a. eine multiple Klonierungsstelle (MCS), antibiotikaresistente Gene zur Klonauswahl, spezifische Tags für die Proteinidentifizierung und -aufreinigung und starke Promotorbereiche zur Förderung der Proteinexpression. Es gibt zahlreiche verschiedene Proteinexpressionsvektoren, da viele dieser Elemente je nach spezifischen Anwendungsanforderungen und dem für die Proteinexpression eingesetzten Zelltyp austauschbar sind.
Bakterien-, Säuger- und andere Proteinexpressionssysteme
Mit schneller Wachstumskinetik und Plasmidtransformationen in E. coli in nur wenigen Minuten sind Bakterien die „Arbeitstiere“ für die Produktion rekombinanter Proteine. Die bakterielle Proteinexpression beruht auf den ribosomalen Untereinheiten 30S und 50S des bakteriellen Ribosoms 70S. Um das Wachstum plasmidfreier Zellen zu verhindern, werden Plasmide mit antibiotikaresistenen Genen zur Identifizierung und Isolierung von Bakterien verwendet, die Plasmide mit der gesuchten proteincodierenden Sequenz enthalten. Während oftmals eine zusätzliche genetische Sequenzierung erforderlich ist, um das Vorliegen der gewünschten Gensequenz zu bestätigen, werden zur Entfernung plasmidfreier Bakterien häufig verschiedene Antibiotika eingesetzt, die eine bakterielle Proteinsynthese blockieren. Neben Bakterienzellen werden häufig auch Insekten-, Hefen- und Säugerzelllinien zur Proteinexpression eingesetzt. Im Gegensatz zu Bakterien enthalten eukaryotische Zelllinien jedoch zusätzliche molekulare Maschinen zur Erzeugung posttranslationaler Modifikationen (z. B. Glycosylierung), die oftmals grundlegend für die Proteinfunktion und aussagekräftige nachfolgende Analysen sind.
Anwendungen der rekombinanten Proteinexpression
Rekombinante Proteine sind Proteine, die innerhalb des proteinexprimierenden Plasmids codiert sind und für maximale Proteinexpression/-aufreinigung modifiziert oder zur Beurteilung der Proteinfunktion mutiert wurden. Die Fähigkeit, die proteincodierende Sequenz selbst um nur ein einziges Nukleotid zu erweitern, zu verkürzen oder zu verändern, stellt Wissenschaftlern ein enorm leistungsstarkes Werkzeug zur Verfügung, um zahlreiche grundlegende Forschungsfragen zu untersuchen und die Funktion des Proteins sowohl in gesundem als auch krankem Gewebe aufzuklären. Die Tragweite der rekombinanten Proteinexpressionstechnologie geht weit über Anwendungen der Grundlagenforschung hinaus und ist essenziell für die Entwicklung lebensrettender Therapeutika und Impfstoffe.
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