Protein-Pulldown

Der Pulldown-Assay dient dazu, die Interaktion von zwei oder mehr Proteinen nachzuweisen. In Affinitäts-Pulldown-Assays wird ein Zielprotein („bait“, Köder) durch kovalente Bindung oder durch ein Affinitäts-Tag, wie z.B. die immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (IMAC), an einen immobilisierten Liganden (Trägerperlen) getaggt und eingefangen. Zu den üblichen bait-Protein Fusions-Tags gehören Glutathion-S-Transferase (GST) und Histidin-markierte Proteine. Das bait-Protein bildet einen Komplex, der dann mit einer Proteinquelle wie Zell- oder Gewebelysat inkubiert wird. Die Zielproteine werden durch eine Reihe von Waschvorgängen vom Perlenträger eluiert und durch Zentrifugation gesammelt. Die Affinitäts-Pulldown-Methode von Aufreinigung und Nachweis unterscheidet sich von Immunpräzipitations- (IP) und Co-IP-Assays dadurch, dass es sich nicht um eine Antikörper-Antigen-Interaktion handelt. Bei allen Pulldown-Assays wird die aufgereinigte Probe häufig mittels SDS-PAGE, Massenspektralanalyse und Western-Blot-Erkennung zur weiteren Downstream-Analyse analysiert.

• Affinitäts-GST-Pulldown-Anwendungen
• Co-Immunpräzipitation

Affinitäts-GST-Pulldown-Anwendungen

Glutathion-S-Transferase (GST) ist ein Protein aus 211 Aminosäuren, das in den meisten Organismen vorkommt. GST wird häufig in Expressionsvektoren integriert, um die Fusionsmarke innerhalb von E. coli-Proteinexpressionssystemen zu erzeugen. Das GST-Tag ist ein großes Protein-Tag mit einer Größe von etwa 26 kDa und kann in Bakterien-, Hefe-, Säugetier- und Insektenzellen exprimiert werden. Das GST-Tag ist von Vorteil, wenn das rekombinante Protein vor intrazellulärer Proteasespaltung geschützt werden muss und wenn die Löslichkeit des markierten Proteins verbessert werden soll. Darüber hinaus bietet das GST-Protein ein Hochaffinitätstag für eine einfache Aufreinigung und für Pulldown-Experimente mit kostengünstigen Affinitätsharzen, die unter milden Elutionsbedingungen durchgeführt werden.

Co-Immunpräzipitation

Der Pulldown-Assay ist ideal zur Überprüfung von Co-Immunpräzipitationsergebnissen und eine ausgezeichnete Methode zur Identifizierung unbekannter Protein-Protein-Interaktionen zusammen mit dem Aktivierungsstatus spezifischer Proteine. Im Gegensatz zu Affinitäts-Pulldown-Methoden werden bei der IP Antikörper eingesetzt, um an Antigene aus komplexen biologischen Proben zu binden und diese zu isolieren.

Co-IP bezieht sich auf die Verwendung eines Antikörpers, um ein Antigen innerhalb eines Multiproteinkomplexes zu binden. Der Komplex wird dann mit der Zugabe von Protein A- oder Protein G-Medium eingefangen. Die hohe Affinität von Protein A/G zum Fc-Teil polyklonaler und monoklonaler Antikörper vom Typ IgG macht sie zu einer kritischen Komponente bei der Aufreinigung des Zielproteins oder Proteinkomplexes. Der Einsatz von Protein-Pulldown-Methoden stellt ein wichtiges Werkzeug für die Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionsnetzwerken dar. Die Wahl der spezifischen Methode wird dabei durch den spezifischen Anwendungsbedarf des Wissenschaftlers bestimmt.