P6782

Perossidasi

Type VI-A, essentially salt-free, lyophilized powder, ≥250 units/mg solid (using pyrogallol), 950-2000 units/mg solid (using ABTS)

• Sinonimo/i: Donatore: idrogeno-perossido ossidoreduttasi, Perossidasi di rafano
• Numero CAS: 9003-99-0
• Classificazione EC (Enzyme Commission): 1.11.1.7 (BRENDA, IUBMB)
• Numero CE: 232-668-6
• Numero MDL: MFCD00071339
• Codice UNSPSC: 12352204
• eCl@ss: 32160410
• NACRES: NA.54

Proprietà

• Tipo: Type VI-A
• Livello qualitativo: 300
• Forma fisica: essentially salt-free, lyophilized powder
• Attività specifica: ≥250 units/mg solid (using pyrogallol); 950-2000 units/mg solid (using ABTS)
• PM: ~44 kDa
• Solubilità: 0.1 M phosphate buffer: soluble 10 mg/mL, clear, orange to red (pH 6.0); H₂O: soluble
• applicazioni: diagnostic assay manufacturing
• Temperatura di conservazione: 2-8°C
• InChI: 1S/H2O3/c1-3-2/h1-2H; JSPLKZUTYZBBKA-UHFFFAOYSA-N

Descrizione

Descrizione generale

La perossidasi di rafano si isola dalle radici del rafano (Amoracia rusticana) e appartiene al gruppo delle perossidasi con ferroprotoporfirina. L′HRP è un polipeptide a singola catena che contiene quattro ponti disolfuro. È una glicoproteina che contiene il 18% di carboidrati. La composizione dei carboidrati include galattosio, arabinosio, xilosio, fucosio, mannosio, mannosamina e galattosamina, a seconda del singolo isozima. Il peso molecolare (circa 44 kDa) include la catena polipeptidica (33.890 Dalton), la emina con Ca²⁺ (circa 700 Dalton) e il carboidrato (circa 9.400 Dalton). Esistono almeno sette isoenzimi di HRP. Il punto isoelettrico degli isoenzimi della perossidasi di rafano è compreso fra 3,0 e 9,0.

Applicazioni

La perossidasi di rafano (HRP) viene isolata dalle radici del rafano (Amoracia rusticana). Trova impiego in applicazioni biochimiche come western blot, ELISA e immunoistochimica. La perossidasi di rafano è usata per amplificare un segnale debole e aumentare la rivelabilità di una molecola bersaglio, ad esempio una proteina. Il prodotto P6782, di tipo VI-A, è una polvere liofilizzata, essenzialmente priva di sali. È usata per quantificare il colesterolo e i suoi esteri e per studiare in vitro la deposizione di lipidi su lenti a contatto in idrogel e silicone idrogel.

L′enzima di Sigma è stato usato nello sviluppo di un biosensore della galattosio ossidasi-perossidasi rapido e sensibile per il rilevamento del galattosio con stabilità prolungata. È stato usato come componente di una piastra di terreno (MRS agar) contenente 3,3′,5,5′-tetrametilbenzidina (TMB) per la crescita di Lactobacillus sp. La TMB agisce come substrato cromogenico della perossidasi. La perossidasi genera O₂ dall′H₂O₂ prodotta dai lattobacilli e la TMB colora le colonie in azzurro in presenza di O₂. Così dopo 48 ore di incubazione con 5% di CO₂ in aria, le colonie che producono H₂O₂ su MRS agar appaiono blu. I non produttori di H₂O₂ sono incolori. È stata usata per studiare l′effetto stabilizzante dell′alcol polivinilico sulla perossidasi di rafano. È stata usata anche per la determinazione del glucosio e dei perossidi in soluzione.

Azioni biochim/fisiol

Incubata con un substrato, la perossidasi di rafano produce un derivato colorato, fluorimetrico o luminescente della molecola marcata, consentendone la quantificazione. La perossidasi di rafano ha dimostrato di ridurre leggermente il livello di inibizione in un mutante cydAB.

L′HRP si combina rapidamente con il perossido di idrogeno (H₂O₂) e il complesso che ne risulta [HRP-H₂O₂] può ossidare diversi donatori di idrogeno. Il pH ottimale è 6,0-6,5 e la stabilità dell′enzima è massima nell′intervallo di pH di 5,0-9,0. L′HRP può essere coniugata agli anticorpi con diversi metodi che includono l′uso di glutaraldeide, ossidazione con periodato, ponti disolfuro e anche per mezzo di agenti reticolanti guidati da ammine e tioli. È più piccola e più stabile rispetto ai marcatori enzimatici, β-galattosidasi e fosfatasi alcalina Di conseguenza è il marcatore preferito. Inoltre la sua glicosilazione comporta un minor numero di legami non specifici. È stato osservato che sodio azide, cianuro, L-cistina, dicromato, etilenetiourea, idrossilamina, solfuro, vanadato, acido p-aminobenzoico, oltre agli ioni Cd²⁺, Co²⁺, Cu²⁺, Fe³⁺, Mn²⁺, Ni²⁺ e Pb²⁺ inibiscono l′attività dell′enzima.

Confezionamento

Confezionata in mg solidi

Linkage

Simile a P8375

Definizione di unità

Una unità ABTS ossiderà 1 μmole di ABTS al minuto a 25 °C, a pH 5,0.

Una unità di pirogallolo forma 1,0 mg di purpurogallina da pirogallolo in 20 secondi a pH 6,0 e 20 °C.

Nota sulla preparazione

Le soluzioni di questo prodotto alla concentrazione di 1 mg/mL in tampone fosfato 0,1 M (pH 6,0) rimangono attive per almeno due settimane a temperatura ambiente. La soluzione conserva l′attività dopo 5 cicli di congelamento e scongelamento.

Risultati analitici

Il RZ (Reinheitszahl) è il rapporto di assorbanza A₄₀₃/A₂₇₅ determinato a 0,5-1,0 mg/mL in acqua deionizzata. Misura il contenuto di emina, non l′attività enzimatica. Anche preparazioni con un RZ elevato possono avere una bassa attività enzimatica.

Questo prodotto viene saggiato con ABTS per confrontarlo con facilità con l′unità di altri fornitori: circa 1000 unità per mg solido

Altre note

Per maggiori informazioni sulla perossidasi visitare la pagina www.sigma-aldrich.com/enzymeexplorer.

Informazioni sulla sicurezza

• Pittogrammi: GHS08
• Avvertenze: Danger
• Indicazioni di pericolo: H334
• Consigli di prudenza: P261 - P284 - P501
• Classi di pericolo: Resp. Sens. 1
• Codice della classe di stoccaggio: 11 - Combustible Solids
• Classe di pericolosità dell'acqua (WGK): WGK 1
• Dispositivi di protezione individuale: Eyeshields, Gloves, type N95 (US)